牙周膜干细胞冷冻保存的研究现状

    牙周膜干细胞是来源于牙周膜组织中的未分化间充质细胞，具有自我更新和多向分化潜能，不仅能促进牙周组织再生，而且在其他非牙齿组织的再生方面也表现出了潜力。然而，有效的应用须建立在有生物学特性保持良好的充足牙周膜干细胞的前提下，因此需要良好的长期冷冻保存程序，不仅要保持细胞的存活，而且要保证细胞的表型稳定性和分化能力。
    这对干细胞治疗、个性化医学和癌症研究等快速增长的领域也具有重要意义。本文根据现有的研究主要阐述了低温冷冻保存牙周膜干细胞的方法及冷冻保护剂的作用机制，对不同技术路线进行比较，综合评估它们的优、缺点。并阐述了冷冻保存对牙周膜干细胞的影响。
    1.牙周膜干细胞的概述
    1.1 牙周膜干细胞的来源和鉴定
    牙周膜是一种弹性结缔组织，位于牙骨质和牙槽窝内壁之间，起支撑和固定颌骨内牙齿的作用。有助于牙齿营养、动态平衡和受损组织的修复。2004年，SEO等首次从牙周膜中分离出干细胞，称为“牙周膜干细胞”，在体外有可能分化为成牙骨质细胞样细胞、脂肪细胞和胶原形成细胞，在体内可形成牙骨质、牙周韧带样结构，并有助于牙周组织的修复，甚至适合于颅颌面部畸形的大型重建。
    获得牙周膜干细胞最常用的方法是通过酶消化法在胎牛血清中扩增。近期，有研究表明，将人牙周膜干细胞与3D生物打印技术获得的SA/Gel/na-HA打印液制成的“生物墨水”混合，制备SA/Gel/na-HA/hPDLSCs细胞生物支架，该细胞生物支架能有效刺激细胞存活、增殖和细胞成骨分化。
    牙周膜干细胞具有以下鉴定特征：细胞呈成纤维细胞样的形态，胞核聚集在细胞中心，胞质形成的突起向外呈放射状，具有成体干细胞的特征；免疫细胞化学检查角蛋白阴性表达，波形蛋白阳性表达；牙周膜干细胞没有特异性细胞标志，对牙周膜干细胞的鉴定通常使用骨髓间充质干细胞的标志，可表达CD105、CD44、CD73、CD166、CD146、CD106，而造血系细胞标志CD45、CD34不表达。体外诱导可分化为成骨细胞、成脂细胞、成软骨细胞及神经元样细胞。因此，牙周膜干细胞鉴定的主要依据是形态、免疫细胞化学检查、表面分子和分化能力。
    1.2 牙周膜干细胞的生物学特性
    牙周膜干细胞不但能分化为成骨细胞、骨形成细胞样细胞、脂肪细胞和软骨形成细胞，还具有分化为神经源性细胞、内皮细胞和心肌细胞的能力。体内外实验表明，牙周膜干细胞是成骨分化的主要调节因子。与不同的生物材料联合可促进因衰老、意外或手术创伤引起的骨和骨化缺陷的骨再生。
    近年来，牙周膜干细胞治疗牙周病的动物模型是研究热点，牙周组织疾病(如牙周炎)的新治疗策略侧重于添加外源性生长因子(如骨形态发生蛋白、血小板衍生生长因子)和干细胞治疗，在大鼠磨牙种植体模型中，牙周膜干细胞与钛种植体一起应用改善了牙周韧带的再生。以TCP-HA为载体，将人根尖乳头干细胞和牙周膜干细胞移植至小型猪体内，结果形成了能够支持瓷冠的活的牙根/牙周复合体。牙周膜干细胞正成为骨髓来源间充质干细胞的替代品，可用于多系分化和再生医学。
    1.3 国际许可的牙科干细胞库
    世界上第一个牙库于2005在日本广岛大学成立，命名为“三个支架”。随着先进的冷冻保存技术的迅速发展，世界各地相继建立了各种国际牙科干细胞数据库，用于研究和临床应用。目前获得许可的牙科干细胞库的数量非常少，主要在发达国家有流行趋势。美国BioEden公司在英国和泰国均拥有国际实验室，位于英国的实验室主要服务于欧洲地区，位于泰国的实验室主要服务于东南亚地区。其余两家美国Store-A-Tooth和StemSave干细胞库公司也在逐渐扩大。
    1.4 牙周膜干细胞的获取
    牙周膜干细胞的纳入标准：①具有健康牙周组织的恒牙；②牙周膜干细胞主要从牙根面中1/3处采集。拔牙前，患者用0.3%的洗必泰含漱2分钟；获取组织后，使用装有低渗磷酸盐缓冲液的冷冻无菌小瓶作为转移缓冲液，于4 ℃转运和储存。
    2.低温冷冻保存技术
    2.1原理
    低温保存的目的是将细胞和组织冷冻并储存在零度以下，以减缓细胞的代谢活动并维持其活力，干细胞在冷冻或解冻过程中往往会受到不可逆转的损害(图1)，与冻融时产生的冰晶对细胞所致的机械性损伤与渗透性损伤双重作用有关。
    快速冷冻过程中，形成胞内冰晶机械性地破坏细胞核与细胞器而致细胞损伤，称为“胞内冰晶损伤”。慢速冷冻过程中，形成胞外冰晶促使大量的水分由胞内向胞外渗出，逐渐导致细胞内渗透压升高，可造成细胞的“溶质性损伤”。如何解决低温冻存生物组织的冻伤问题是冷冻保存成功的关键。需要选择使损伤达到最低的降温速度。此外， 最佳降温速度还与冷冻保护剂种类、浓度等多主面因素有关。
    2.2 降温方法
    2.2.1 控速冷冻
    可控速率冷冻作为组织工程技术的传统保存方法，能最大限度地减少低温保存过程中脱水和冰晶形成对干细胞的损害。每分钟1～2 ℃降温的低冰冻速率，通常被认为是在冷冻保存期间保持干细胞活性的最佳选择。但是该方法操作复杂，耗时费力，设备成本高。另一种方法是超慢冷冻速度，以0.3～0.6 ℃/min的速度受控降温，成本更高。与快速冷冻法相比，使用控速冷冻解冻后的细胞生长和活力明显更高。缓慢、控速冷冻能减少活细胞冰伤害，移植后牙周再生与即时移植相似，而快速冷冻的牙齿移植后则导致进行性牙根吸收。
    2.2.2 不受控速冷冻
    不受控速冷冻即将组织或干细胞样本首先预冷到4 ℃，然后直接放入-80 ℃的冷冻箱或液氮中。这种快速冷冻方法的原理是在高浓度冷冻保护剂时形成受阻液体状态和玻璃状凝固，又称为“玻璃化冷冻”，这种方法更简单，然而，高浓度的冷冻保护剂通常对大多数细胞是有毒的。通过快速冷冻存活下来的卵母细胞比慢速冷冻的卵母细胞更多。但快速冷冻法后牙周膜细胞活性低于控速冷冻。
    2.2.3 磁力冷冻
    近年来，有学者提出“细胞活体系统”(Cell alive system， CAS)的磁场冷冻，磁性冷冻保存被认为是一种受控的慢速冷冻技术。程序冰柜的磁场为0.01 mT，以0.5 ℃每分钟的速度降温至-30 ℃，然后，将冷冻保存的样品保存在-150 ℃冷冻箱中。这种方法被认为能最大限度的保存细胞活性。
    CAS冷冻箱组冷冻保存的牙周膜干细胞存活率明显高于无磁场的普通冷冻箱。CAS冷冻保存的PDL细胞与对照组相比，在mRNA表达或I型胶原蛋白方面没有差异，碱性磷酸酶轻微下降。CAS冷冻箱进行长期冷冻保存不会影响牙周膜细胞的生长速度和特性，细胞增殖能力与新鲜牙相当，细胞未见任何破坏。使用磁场程控冷冻机的牙库可以用于将来的自体移植，作为一种替代缺失牙齿的治疗方式。
    2.3 冷冻保护剂
    在冷冻过程中，冷冻保护剂用于保护细胞免受冰晶形成的影响。主要分为两大类：①渗透性冷冻保护剂，如甘油、乙二醇、二甲基亚砜，它们可以穿透细胞质膜，防止冰晶核的形成，并减缓细胞内冰晶的生长。②非渗透性冷冻保护剂，例如葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。它们留在细胞外空间，允许细胞脱水和减少细胞内冰晶的形成，并稳定细胞膜。
    牙周膜干细胞冷冻保存所选择的低温保护剂主要是10%二甲基亚砜，二甲基亚砜具有细胞毒性，二甲基亚砜保存的骨髓细胞已被证明会在移植后引起不良反应。近期，发现存在于自然界的天然共深晶体可作为潜在的冷冻保护剂，具有降解性高、成本效益高、毒性低等特点。天然共深晶体组分与水之间的分子间氢键导致溶液熔点的强烈下降，减少冰晶形成，并保护细胞免受渗透损害。与二甲基亚砜联合使用可提高解冻后细胞的活力。
    2.4 复温
    目前，使用的最广泛的标准程序是37 ℃的水浴，并保证复温时间在3 min内。这种方法可以有效地去除冰晶，并且对细胞的潜在损害最小。同时注意解冻后应将残留的冷冻保护剂逐步完全去除。有学者发明了一种自动解冻装置，利用弹簧铰链将玻璃化细胞快速输送到预热的介质中，解冻后小鼠成纤维细胞活性高于传统冷冻保存复温方法。这对于深低温或CPA耐受性的细胞是一种很好的复温替代方案。
    3.低温冷冻对牙周膜干细胞的影响
    3.1 对生物特性的影响
    许多临床报告和动物实验表明，冷冻保存后的牙齿能获得正常牙周愈合，牙周膜细胞在冷冻状态下可以存活。也有研究者认为冷冻过程中形成细胞内冰晶和细胞外结冰引起的机械应力的损伤，导致牙根吸收和强直。结合冷冻保护液的使用及良好的控制冷冻降温速率，冷冻后牙周膜干细胞的存活率、增殖能力、多向分化潜能没有显著改变。
    但冷冻保存5年的牙周膜细胞从组织中迁移的时间是新拔出牙齿的两倍。CAS冷冻对牙周膜干细胞I型胶原、碱性磷酸酶和血管内皮生长因子的表达无影响，而冷冻后FGFR2的表达明显减少。目前，牙周膜干细胞经过长时间的冷冻保存后，在多大程度上能够保持其分化能力和形态功能，尚需全面深入研究。
    3.2 对蛋白质组的影响
    冷冻后的自体牙移植成功的关键不仅受牙周膜细胞的活性的影响，还可能与蛋白质或细胞外基质有关。冷冻牙周膜细胞中波形蛋白表达最显著，其次是VI型胶原。在波形蛋白缺陷小鼠中，成纤维细胞迁移到伤口部位的时间延迟，导致伤口收缩减慢。波形蛋白在低温贮藏条件下持续出现，但在干燥贮藏条件下其水平迅速下降。由此推断，低温冷冻可能促进波形蛋白的表达，在牙周细胞的再附着和再生中发挥着重要作用。这些蛋白在冷冻保存再植的牙周愈合中的作用还需要进一步的研究。
    3.3 对细胞因子的影响
    成纤维细胞生长因子存在于早期外胚间充质，刺激PDL 的血管生成、趋化和未分化外胚层细胞的增殖，引导牙周再生。在冷冻保存的牙齿培养中比即刻组表达下降两倍，表明冷冻影响牙周膜干细胞中 FGFR2 基因的表达。
    巨噬细胞集落刺激因子是调节破骨细胞引起骨吸收的细胞因子之一。在口腔中，牙周膜细胞产生的巨噬细胞集落刺激因子通过调节局部的前破牙本质细胞的分化和激活来影响牙根吸收。冷冻保存可增加牙周膜细胞巨噬细胞集落刺激因子的表达，这提示深低温保存可能通过增加M-CSF的表达影响牙根的分化而在诱导牙根吸收中发挥作用。
    4.小结与展望
    目前，牙周膜干细胞在再生医学领域及干细胞介导的临床治疗和组织工程方面具有良好的应用前景。这一方面因其在体内易获得性，另一方面是在体外具有血管生成、免疫调节和多向分化能力。目前尚未有用于牙周膜干细胞冷冻保存的标准方案。更合理的的冷冻保护剂及实现最优化的冷冻保存方案是牙周膜干细胞应用于再生医学领域要面对的重要挑战。