凋亡抑制基因bcl-2在牙胚发育中的作用

　　摘要　目的：通过检测牙胚发育中bcl-2基因、蛋白的表达及细胞凋亡的情况，探讨bcl-2基因及细胞凋亡在牙齿发育中的作用。方法：利用原位末端标记法（TUNEL）、原位杂交及免疫组织化学技术分别对SD大鼠牙胚发育不同时期bcl-2 mRNA、蛋白的表达及细胞凋亡进行研究。结果：在牙胚发育的各时期均有细胞凋亡现象及bcl-2 mRNA、蛋白的表达。bcl-2 mRNA早期在上皮性成釉器及周围的间充质细胞尤其是生长中心部位表达明显。牙体组织形成后各部位阳性表达逐渐减弱、消失；bcl-2蛋白与mRNA的表达基本一致。早期凋亡细胞集中出现在细胞生长中心处。牙体组织形成后散在可见。结论：bcl-2基因可能是牙齿发育中的细胞生长、增殖及凋亡的内在调控基因之一，参与了牙齿发育的重要塑形过程。
　　　
　　研究表明，细胞凋亡（apoptosis或programmed cell death ，PCD）在胚胎发育、器官形成、变态反应、肿瘤发生及保持机体的稳态中发挥着至关重要的作用^［1］。而细胞凋亡与细胞增殖一样受多种基因的调控^［2］。那么，牙齿发育中凋亡抑制基因bcl-2是否表达又是否对细胞凋亡现象发挥着调控作用，尚未见此方面的报道。为此，本研究通过观察SD大鼠牙胚发育中bcl-2表达与细胞凋亡关系，初步探讨牙齿发育的机制。

1　材料和方法
1.1　动物模型及标本制备
　　选用纯系、3月龄SD大鼠（上海产）20只，按雌雄4：1的比例同笼，每天早晨8：00观察雌鼠阴栓，以观察到阴栓计为妊娠0d，分别于妊娠13、15、17、19d脱颈处死大鼠，切取胎鼠头部置于40g/L的多聚甲醛中固定，另取出生后1、3、5、7d幼鼠，均取头部（沿正中线切开鼠头后分切）置入含盐酸、甲酸、冰醋酸的40g/L多聚甲醛液中充分固定、脱钙，流水冲洗后，常规脱水、石蜡包埋。行冠状和矢状面5μm切片，分别用于TUNEL染色、原位杂交及免疫组织化学染色。
1.2　原位末端标记法（TUNEL法）标记PCD细胞
　　TUNEL法（试剂盒购自美国Oncor公司）：切片常规脱蜡至水，室温下20mg/L的蛋白酶K消化15min；30ml/L H₂O₂ 的PBS溶液中处理5min后，加50μl的平衡液（TUNEL试剂盒原配）1min；再加含TDT酶反应液15μl，37℃孵育1.5h后用预热的中止反应液中止反应（TUNEL试剂盒原配）；buffer1漂洗2次（15min/次）后加20ml/L 的正常羊血清孵育30min；滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体置于湿盒中孵育2h；经buffer1 、buffer3漂洗后，加新配制的显色液 (NBT/BCIP显色系统，用buffer3配制，NBT4.5μl、BCIP3.5μl、左旋咪唑0.24mg/L) 20μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
1.3　原位杂交检测bcl-2基因的表达
1.3.1　探针及标记：质粒pDOR-SB8.4（第四军医大学生化教研室朱峰博士惠赠）含1.9kb的bcl-2基因片段。取已鉴定的质粒DNA，经EcoRI酶切后，将目的基因用冻溶法回收。bcl-2探针参照地高辛标记检测试剂盒（Boehringer Mannheim公司）说明书，采用随机引物法标记。
1.3.2　bcl-2原位杂交：石蜡切片脱蜡至DEPC水，分别用0.2mol HCl和20mg/L的蛋白酶K处理，梯度酒精脱水后室温干燥。用地高辛标记探针于42℃杂交后，分别用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC、buffer1、buffer2依次充分洗涤，再用质量浓度20ml/L 正常羊血清封闭30min后，滴加抗地高辛碱性磷酸酶抗体2h，经buffer1 、buffer3漂洗后，加新配制的显色液 (NBT/BCIP显色系统) 20μl，暗处显色。中止显色后，梯度酒精脱水，二甲苯透明封片。
1.4　免疫组织化学检测bcl-2蛋白的表达
　　石蜡切片脱蜡至水，经30ml/L H₂O₂封闭内源性过氧化物酶及枸橼酸缓冲液微波修复抗原10min后，用正常羊血清封闭30 min；加bcl-2 抗体（兔抗鼠多抗，美国Santa Cruz 公司产品）置于4℃过夜，室温下复温1h后滴加生物素化羊抗鼠二抗37℃反应30 min ；再加ABC复合物37℃孵育30 min，DAB显色后，二甲苯透明、封片。