摘要 目的：探讨牙齿正常状态和炎症过程早、中、晚期胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)的基因表达变化。方法：在大鼠牙髓炎模型上，分别摘提取正常鼠及炎症鼠早、中、晚期的尾侧亚核,提取总RNA,用RT-PCR一步法扩增GDNF mRNA,琼脂糖凝胶电泳照像。结果：正常鼠尾侧亚核GDNF mRNA有一定水平的基础量表达；炎症急性期GDNF mRNA表达量略有下降；炎症修复期GDNF mRNA表达量上升至高峰后回落至高于基础表达量的水平。结论：牙髓炎修复期GDNF在尾侧亚核F的表达增高，提示GDNF可能参与炎症牙髓神经修复再生过程，对神经末稍再生发芽有促生长作用。
胶质源性神经营养因子 (glial cell line-derived neurotrophic factor ，GDNF)是新近发现的神经营养因子家族成员之一，其较NGF具有更强的促神经再生能力［1,2］。GDNF除存在于神经系统外，还存在于感觉神经丰富的器官如：牙齿、眼、鼻。牙髓神经快速生长期GDNF在牙胚组织表达较强，可诱导三叉神经向髓腔伸长，并对牙髓神经的发育起重要促进作用［3］。有关在炎症状态时GDNF表达是否改变及其与牙髓神经再生修复的关系目前尚未见研究报道。本实验利用RT-PCR技术研究正常鼠和牙髓炎症鼠的不同时期GDNF在牙髓神经中枢尾侧亚核表达量变化，探讨GDNF是否参与炎症修复期牙髓神经再生，及其在牙髓炎症反应中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料
高速低温离心机(Sigma 2MK)；eppendorf PCR仪(Germany)；烤箱(101-2型，上海实验仪器厂)；水平电泳仪(上海实验仪器厂)；紫外灯显像及照像系统(MODEL 2F-3，上海实验仪器厂)。
Trizol总RNA提取试剂盒(Gibco USA)；一步法RT-PCR试剂盒(Gibco USA)；PCR Marker(华美生物工程公司)；DEPC水，(Gibco USA)。
1.2 方法
1.2.1 鼠牙炎症模型建立和分组
运用5g/L的α－内毒素（Sigma公司，USA）作用在鼠牙右侧的穿髓点15min，然后用玻璃离子水门汀封闭制做炎症牙髓模型［14］。按封药后观察时间的长短分3d组、6d组、9d组、12d组，以及正常鼠牙组共5组。 此模型特点为牙髓存活时间长，牙髓组织有足够时间参与免疫应答及免疫防御过程，机体有足够时间展示修复再生功能［4］。
1.2.2 尾侧亚核总RNA的抽提
不同时间点处死动物，心脏灌注后开颅取双侧尾侧亚核。将各组的尾侧亚核放入2ml的匀浆器，加入1ml Trizol变性液中充分匀浆，异丙醇沉淀，氯仿抽提，750ml/L乙醇洗去盐份，所得的沉淀物用30μl DEPC处理过水溶解，取其中5μl释液100倍后测A260、 A280 、 A230 ，A260/A280>1.7, A260/A230>1.5，若低于1.7、1.5的标准线，表示有蛋白质污染和盐分残存。
1.2.3 引物设计（第四军医大学神经生物研究所，宋俊峰博士惠赠）
由军科院八所合成，其序列5\'端引物5\'-TCA CCA AAA CAA ATG GCA GTG-3\',3\'端引物5\'-GGA CGA CTC AGA TAC CAC ACC TTT TAG-3\'5\'端引物3\'端引物浓度为25pmol.
1.2.4 一步法RT-PCR
在50μl反应体积中含引物P1引物P2各1μl，MgSO43μl,2×反应缓冲液25μl(内包括四种NTP各0.4mMol)，加模板1ng 根据A260=1 的 RNA 溶液每豪升约含40μgRNA，计算出各组模板量1ng所需的体积数，加DEPC处理过水至49μl，后94℃，5min，放冰浴骤冷从而可减少DNA的二级结构形成，然后加RT/Tag混合酶1μl， 后加石蜡油20μl覆盖，以避免反复升温所致的水分的散失。各样品在55℃孵育，30min，反转录cDNA链后,进入PCR程序(94℃，3min，杀灭不耐高温的反转录RT酶的活性后，按94℃，40s，55℃，1min，72℃，1min顺序循环30次，72℃延伸5min，温度降至4℃)。待PCR完成， 样品移至-20℃冰箱保存。
样品制备完成后取样10μl,20g/L琼脂糖凝胶电泳检测正常组，炎症3d组，炎症6d组，炎症9d组，炎症12d组PCR产物量
