摘要 目的：比较和分析急性牙髓炎和牙齿开髓刺激对三叉神经节中PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的影响。方法：利用斑点杂交分析方法。结果：开髓1h后两种mRNA表达增高，2h持续增高，4h仍维持较高水平。炎症2h组两种mRNA均有高表达，4h组mRNA含量高于2h组。任何一组的CGRP mRNA杂交信号强于PPTA mRNA杂交信号。结论：两种刺激均增加三叉神经节中P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）的合成。
SP、CGRP主要存在于三叉神经节的中小神经元中［1～3］，这些神经元是参与痛觉信息传递的主要神经元。研究发现大鼠急性牙髓炎时三叉神经节中SP、CGRP免疫阳性结构增多。我们已经观察到大鼠急性牙髓炎早期及牙齿开髓刺激引起三叉神经脊束核尾侧亚核区域SP、CGRP免疫阳性纤维数量减少。尚未明确这一现象的原因是由于纤维末梢大量释放所致，还是由于三叉神经接种神经元合成减少所致。因此，我们将应用斑点杂交分析方法观察大鼠牙齿伤害性刺激后，三叉神经节中PPTA mRNA，β-CGRP mRNA含量的变化。
1 材料和方法
1.1 实验分组、动物模型制备和取材
选用雄性SD大鼠，165～230g，分6组：①正常对照组(n=4)，②急性牙髓炎2h组(n=6)，③急性牙髓炎4h组(n=6)，④开髓1h组(n=6)，⑤开髓2h组(n=6)，⑥开髓4h组(n=6)。4g/L戊巴比妥钠(1ml/100g)腹腔注射麻醉。麻醉生效后，实验组大鼠第一磨牙面开髓至点状露髓，探针搔刮穿髓点3～4次。炎症组大鼠封1%角叉菜胶2h或4h。开髓组封生理盐水1h、2h或4h。正常对照组麻醉后存活2h处死。待动物达规定时间点后，将动物乙醚吸入麻醉后迅速断头取三叉神经节，放入液氮中速冻。
1.2 提取三叉神经节总RNA并定量
按改良Chomczynski RNA快速提取方法提取三叉神经节组织总RNA，紫外分光光度计测波长260和280的A值。计算各样本总RNA含量和纯度。取A260/A280>1.9者点膜。
1.3 杂交膜制备
取总RNA加等体积RNA变性液65℃变性30min。取10μg(PPTA mRNA杂交用)或5μg(CGRP mRNA杂交用)变性RNA点于硝酸纤维素膜，室温静止20min，80℃烘烤2h待用。
1.4 探针制备和标记
实验用探针由Applied Biosystem 381A DNA合成仪合成。均为寡核苷酸探针。PPTA探针含30个碱基，其序列与大鼠脑内PPTA mRNA的第175号碱基到第204号碱基互补。β-CGRP探针含有35个碱基，其序列与大鼠脑内β-CGRP mRNA的第656～690号碱基互补。合成的探针由3\'末端标记法进行γ-32PdATP标记。
1.5 斑点杂交及分析
将硝酸纤维素膜和预杂交液封于杂交袋中，42℃预杂交16h。将标记探针(2μg)加入杂交袋中，42℃，12h。洗膜后，暗盒内X光胶片放射自显影3d，洗片。扫描仪扫描，计算各样本灰度值。
2 结果
放射自显影结果显示，未经处理的对照组PPTA mRNA和β-CGRP mRNA均有较高水平表达，开髓1h后两种mRNA表达增高，2h持续增高，4h仍维持较高水平。炎症2h组两种mRNA均有高表达，4h组mRNA含量高于2h组。任何一组的CGRP mRNA杂交信号强于PPTA mRNA杂交信号(图1 ,2,3,4)。
图1 图2
A：正常组；B：开髓1h组；C：开髓2h组；
D：开髓4h组；E：牙髓炎2h组；F：牙髓炎4h组
图1 牙齿伤害性刺激对三叉神经节中PPTA mRNA的影响
图2 牙齿伤害性刺激对三叉神经节中β-CGRP mRNA的影响
图3 牙齿开髓组三叉神经节神经元PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的表达
图4 牙髓炎组三叉神经节神经元PPTA mRNA、β-CGRP mRNA的表达
3 讨论
PPTA（前速激肽原A）是编码SP的前体。PPTA mRNA 主要存在于三叉神经节的中、小神经元中，三叉神经节中只有少量神经元表达PPTA mRNA［8］。β-CGRP mRNA主要位于三叉神经节的中、小神经元中［6］，β-CGRP可能与痛觉传递有关。
Donaldson发现［4］鼠后肢注射佐剂后8h，背根神经元中PPTA mRNA和CGRP mRNA增多。同侧坐骨神经麻醉后可以防止PPTA mRNA和CGRP mRNA的变化。本实验也证实给予牙髓炎性及机械损伤性刺激，增加三叉神经节中PPTA mRNA和CGRP mRNA的表达，证实伤害性刺激增加背根神经节中和三叉神经节中PPTA mRNA和CGRP mRNA的表达增加，加速合成SP和CGRP，其意义在于大量合成的SP和CGRP通过轴浆运输到达末梢区域，为伤害性刺激引起的SP和CGRP的释放提供底物。逆行标记牙髓神经结合酶免疫组织化学研究证实
