牙龈成纤维细胞作为种子细胞在组织工程研究中的应用进展

2017-12-15 11:12 来源:医学综述
作者:陈潇 刘旭倩 张海燕阅读量:3872

    组织工程研究包括三个重要因素:种子细胞的来源;支架材料的选择;细胞因子的应用。其中种子细胞的来源是组织工程研究三因素中最为重要和关键的因素,种子细胞可根据不同的诱导环境和诱导条件分化形成各种组织工程化组织器官构建所需要的细胞。种子细胞的来源十分丰富,其中应用最多的为干细胞,它是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞,同时也是一种尚不成熟,未充分化的细胞,具有可构建并再生形成各种组织器官的功能。

    在特定的条件下,干细胞可以分化形成多种功能的细胞。按照干细胞发育潜能的不同可将其分为单能干细胞、多能干细胞和全能干细胞。而按照干细胞发育阶段的不同则可将其分为胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)和成体干细胞。在众多分类中用于构建组织工程化组织器官的种子细胞尤其以成体干细胞的应用最为广泛,这些成体干细胞包括骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)、脂肪间充质干细胞、人羊膜来源的间充质干细胞(humanamniotic mesenchymal stem cell,hAMSC)以及脐带来源间充质干细胞等。然而,这些间充质干细胞尽管来源广泛,但其在来源组织中的可获取数量十分有限,获取高纯度的间充质干细胞也就十分困难,另外,即使获取了一定数量的间充质干细胞,其鉴定也是学者们所面临的难点。

    近年来,研究者们发现,牙龈成纤维细胞(gingival fibroblasts,GFs)具备类似干细胞的特性,具有多项分化的潜能,成为组织工程化组织器官构建所需要的新型种子细胞来源。现就GFs作为种子细胞在组织工程研究中的应用情况作一综述。

    1.种子细胞应具备的特点

    应用组织工程的方法再造组织和器官所用的各类细胞统称为种子细胞。因此,组织工程研究中最重要的一点就是要获取足够数量的接种细胞,与此同时,这些接种细胞也必须满足能够持续增殖、合成基质的功能和防止细胞衰老等特点。首先,种子细胞的获取应满足采用非侵袭手段和微创手段来获得,通过大面积的创伤性手术来获得的种子细胞尽管数量丰富,但其获取过程对机体也存在一定的损伤;其次,种子细胞的性能应满足分裂增生能力强和功能旺盛等特点,这就要求种子细胞能够不断扩增,以求达到组织工程化组织器官构建所需要的细胞数量;再次,种子细胞的相容性要求细胞种植于支架材料后或接种于体内后没有或仅有极微弱的免疫排斥反应;最后,种子细胞的延续性应满足能够连续传代,并且经过传代培养后不会发生形态学、功能学及遗传性质的改变。

    2.种子细胞的分类来源及应用限制

    组织工程研究中种子细胞的来源十分丰富,其中干细胞的研究是目前的焦点和热点,在干细胞的研究中尤其以ES和成体干细胞的研究最为广泛。其中,ES的研究应用一直颇具争议,ES虽然能分化形成各种细胞类型,但不能控制其在特定部位分化形成相应的细胞,不但存在安全性和伦理学问题,而且其在植入体内后亦有致畸作用,容易形成畸胎瘤,这使ES的应用受到限制,目前研究者们正在致力于尝试其他途径代替ES,如可通过细胞重编程技术使患者的体细胞转化为干细胞后再进行组织工程后续应用。而成体干细胞的分类则更为广泛,也是目前为止组织工程化组织器官构建所需种子细胞的主要获取途径,其可来源于多种组织,如来源于骨髓组织的BMSC、来源于脂肪组织的脂肪间充质干细胞、来源于羊膜组织的hAMSC、来源于脐带组织的脐带间充质干细胞,以及来源于泌尿系统组织的间充质干细胞等。

    如果应用ES对患者进行治疗,必须先将细胞进行诱导分化,来防止畸胎瘤等发生,同时必须确认ES的提供者没有遗传性疾病。然而如果应用成体干细胞对患者进行治疗就不存在致畸问题,即不会形成畸胎瘤。尽管成体干细胞具有比ES更多的优势,但由于成体干细胞缺乏特异性的表面标志物,因此到目前为止,学术界仍然未找到鉴定成体干细胞的金标准,对于其鉴定往往是在活体组织中标记细胞,然后再通过鉴定它们所产生的特定细胞类型反过来对标记细胞进行鉴定,从而推测标记的细胞为成体干细胞。还可以将细胞从活体组织上分离出来,标记并进行细胞培养,将扩增后的细胞移植入另一动物体内,通过观察该细胞是否可以再生其来源组织来间接鉴定成体干细胞。另外,还可以通过将分离细胞培养扩增后加入生长因子或向细胞内导入基因的方法来控制细胞分化方向,从而间接鉴定成体干细胞。国际干细胞治疗学会也提出了间充质干细胞的鉴定标准:尽管间充质干细胞没有特异性的表面标志物,但其可群体表达CD105、CD90、CD73,而群体不表达CD34、CD45、CD11b、CD14、CD19。但这种鉴定手段必然需要昂贵的费用。再者,间充质干细胞在培养过程中极为不稳定,以BMSC为例,BMSC已经被证明是最重要和应用最广泛的间充质干细胞来源。

    但是,BMSC的获取和培养过程中始终存在许多制约:①BMSC的培养过程中细胞的早期衰老问题始终无法克服,随着传代过程的进行,细胞容易逐渐失去干细胞的特性,表现为分化能力减弱。②间充质干细胞在取材时所面临的创伤比较大,这里仍以BMSC为例,BMSC在取材时要抽取患者或捐赠者的正常骨髓组织,这无疑给患者或捐赠者带来极大的痛苦,往往令人难以接受。总之,以BMSC为代表的间充质干细胞虽然具备多向分化的潜能,但其在细胞培养过程中缺乏特异性表面标志物、极易早期衰老、取材时对患者创伤性大等不足使其作为组织工程种子细胞受到不同程度的限制。

    针对这些限制,有研究证实,牙龈中的成纤维细胞具有类似干细胞的特性,在特定的诱导条件下能够分化形成多种类型细胞,具有多向分化的潜能。因此,牙龈细胞能够克服间充质干细胞的不足,在应用于组织工程时体现出一定的优势。

    3.牙龈在取材、细胞培养和细胞鉴定中的特点及优势

    牙龈组织属于口腔黏膜中的咀嚼黏膜,组织学中将其分为上皮层和固有层,由于牙龈组织参与口腔的咀嚼运动功能,因此固有层直接附着在牙槽骨上,无黏膜下层。对于正常牙龈组织的取材往往来源于口腔中行阻生齿的拔除手术或者埋伏牙的拔除手术。因此口腔医师获取牙龈组织十分方便,更重要的是,由于口腔唾液中存在大量的透明质酸成分,从而使牙龈组织切除愈合后不留有瘢痕组织,不影响患者的美观和口腔行使正常功能,这一点无疑从很大程度上克服了间充质干细胞特别是BMSC取材时破坏正常组织的缺陷,免除了取材时的痛苦,患者或捐赠者更容易接收。牙龈组织中的固有层,即结缔组织,是牙龈最主要的组成部分,其中GFs作为牙龈结缔组织固有层的主要细胞成分具备非常强的修复和再生能力。

    对于GFs的培养和扩增,其过程简单,往往采用原代培养的方法,继而进行传代扩增,由于GFs在一定意义上属于成熟体细胞,虽然传代次数有限,但是在有限的代次中其形态学、功能学和遗传性质不会发生改变,能够保持细胞的遗传稳定性,经过传代后的细胞仍然具备强大的修复和再生功能。从这个方面来说,克服了间充质干细胞应用于组织工程时早期阶段就发生衰老的缺点。另外,研究表明,GFs的鉴定具有其特异的表面标志物,如波形蛋白(vimentin),Ⅲ型胶原蛋白等,比间充质干细胞鉴定必须群体表达CD105、CD90、CD73,而群体不表达CD34、CD45、CD11b、CD14、CD19的方法更为简单和经济。从这个方面来说,解决了间充质干细胞应用于组织工程时缺乏特异性表面标志物的缺陷。

    4.GFs作为种子细胞在构建组织工程化组织器官中的应用

    众多学者经过大量研究,发现干细胞成分广泛存在于牙源性组织中,其中最为常见的几种有牙周膜来源的干细胞、牙髓来源的干细胞、脱落乳牙来源的干细胞以及牙囊来源的干细胞等。以上几种干细胞均属于牙源性的间充质干细胞,特别牙周膜来源的干细胞近年来已成为研究的焦点,但是无论哪一种牙源性的干细胞都存在上述间充质干细胞应用的限制问题,如取材问题,无论是健康的牙周膜、健康的牙髓组织还是健康的牙囊组织,其获取过程都十分不易,健康的牙周膜往往来源于正畸拔除健康牙后周围正常的牙周组织或者实验动物的健康牙周膜,健康的牙髓来源于正畸拔除的健康牙体组织中的牙髓成分或者实验动物的健康牙髓成分,健康的牙囊取材更为困难,牙囊只存在于牙体组织的发育过程中,一般情况下不能获取,只能取自智齿的牙囊组织或实验动物的健康牙囊。

    然而,研究者发现牙龈的结缔组织和牙周膜组织主要是由成纤维细胞组成,并且已经证实了牙周膜成纤维细胞中存在成骨和成牙骨质细胞表型,可以向成骨细胞和成牙骨质细胞方向分化,以达到修复和再生牙槽骨和牙骨质的目的。牙龈组织作为牙周组织中最重要的组成部分,其来源的GFs与牙周膜组织来源的成纤维细胞相比具有更强的增殖能力。研究表明,由于GFs中存在具有成骨细胞表型和成软骨细胞表型的干细胞,因此研究者可以诱导GFs分化形成骨组织或软骨组织,从而证实GFs具有自发的生成骨或软骨组织的能力。另外,已被证实GFs能够作为具有高增殖能力的诱导多能干细胞来源。这说明GFs可能具有多向分化的潜能,有类似于干细胞的特性。

    尽管有学者证实与BMSC相比,牙龈组织中的间充质干细胞更易被纯化和分离出来,并且牙龈来源的间充质干细胞能在相当长的一段时间内保持干细胞的特性,具备向软骨组织、脂肪组织和骨组织等方向分化的能力,但是直接从牙龈组织中分离出来的间充质干细胞的数量仍然十分有限,仅占GFs总数中的3%左右,其鉴定和纯化细胞的特异性方法和技术同其他间充质细胞一样并不完善,这充分说明获得牙龈来源的间充质干细胞存在一定困难。Liu等将人来源的GFs作为种子细胞进行原代培养及扩增,而后进行特定条件下诱导培养,诱导后细胞向血管内皮样细胞方向分化。

    在该研究中诱导后细胞的形态学结构从最初的丛状分布逐渐向鹅卵石或铺路石样形态分化;免疫细胞化学显示CD31、CD34、血管性假性血友病因子和血管内皮细胞钙黏素在诱导后的细胞质中呈阳性表达;透射电子显微镜显示诱导后细胞的超微结构,细胞表面出现微绒毛样结构,而在诱导后的细胞质中除含有粗面内质网、溶酶体等细胞器外还可观察到Weible-Palade(W-P)小体样结构;成管能力测试实验结果显示,诱导后形成的血管内皮样细胞能够形成类似于血管腔样结构。这些结果充分说明人来源的GFs能够诱导分化形成血管内皮样细胞,具备一定的分化潜能。

    Liu等在以上实验研究基础上进一步证实,GFs在血小板衍生因子和转化生长因子β1两种细胞因子联合诱导条件下能够分化形成血管平滑肌样细胞。在该研究中诱导后细胞的形态学结构从丛状分布逐渐向“峰谷”状结构生长;免疫细胞化学显示:α平滑肌肌动蛋白、平滑肌肌球蛋白重链、碱性调宁蛋白在诱导后的细胞质中呈阳性表达;透射电镜结果显示,诱导后细胞中只含有少量典型的细胞器,而在细胞质中可见大量粗细不一和平行排列的肌丝样结构并形成肌丝束,以及电子密度较高的密体样结构。这些结果均提示GFs能够在体外诱导分化形成血管平滑肌样细胞。以上研究表明,尽管GFs不是干细胞,但是却具有一定的类似于干细胞的特性,具备多向分化的潜能。

    5.小结

    GFs作为一种修复和再生能力极强的牙龈结缔组织来源的细胞,逐渐被应用于组织工程的研究中,虽然GFs并不是从牙龈组织中直接分离出来的间充质干细胞,但越来越多的研究证实了其具有多向分化的潜能,能够在不同细胞因子诱导作用下分化形成软骨细胞、骨细胞、内皮样细胞以及平滑肌样细胞,从一定程度上克服了间充质干细胞取材困难、含量少、缺乏特异性鉴定方法和容易早期衰老等缺点,为组织工程种子细胞的研究提供了新的途径和思路。然而,尽管GFs已被证实具有多向分化的潜能和具有类似于干细胞的特性,但目前的许多研究仅仅局限于形态学和免疫学的范畴,对于其多向分化的原理和机制尚不清楚,有待研究者们进一步探索。

编辑: 陆美凤

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