【摘要】 目的 体外定向诱导人牙周膜干细胞分化为神经元样细胞，探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法 体外分离、培养人牙周膜细胞，待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养，筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC），用含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的预诱导培养液诱导培养24 h，然后换用含5 mmol/L β-巯基乙醇（β-ME）的诱导培养液诱导培养6 h，光镜下观察诱导细胞形态学的改变，免疫荧光、RT-PCR等方法检测鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。同时以未诱导细胞为对照。结果 体外诱导培养6 h细胞即发生形态学改变，可看到典型的神经元样细胞；免疫荧光、RT-PCR检测诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE、NF，未诱导细胞无表达。结论 人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为神经元样细胞，具有多向分化的潜能。
【关键词】 牙周膜干细胞 神经元样细胞 诱导分化
牙周膜细胞是牙周组织的主要功能细胞，在牙周组织再生中起重要作用[1]。大量的研究[2－4]表明，牙周膜细胞具有异质性，能在体外形成矿化结节并表达骨相关标记物，如碱性磷酸酶和骨涎蛋白等，另外，它还能对甲状旁腺素、胰岛素样生长因子等骨诱导因子做出反应。因而，有人推测牙周膜中也存在一种具有多向分化潜能的干细胞。2004年，Seo等[5]首先从牙周膜中分离培养并鉴定出了牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）。具有多向分化潜能是干细胞的主要标志之一，本研究对PDLSC进行分离、培养并向神经细胞方向进行诱导分化，探讨其多向分化潜能，希望为牙周组织工程种子细胞的筛选提供一定的实验基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
α-MEM（杭州吉诺生物技术公司），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、胎牛血清（Gibco公司，美国），碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastic growth fac-tor，bFGF）、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）（Sigma公司，美国），鼠抗人波形蛋白、角蛋白、CD146单克隆抗体（Abcam公司，英国），鼠抗人STRO-1单克隆抗体（R&D公司，美国），SP免疫组化试剂盒、鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、神经丝蛋白（neurofilament，NF）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP）多克隆抗体、FITC荧光标记二抗（武汉博士德生物有限公司），细胞总RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒（北京天根公司）。
1.2 方法
1.2.1 牙周膜细胞原代培养 收集临床上12～18岁因正畸需要拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙, PBS洗3次，刮取根中1/3牙周膜组织，采用酶解组织块法培养，3 d换液，直至细胞从组织块周围游出，细胞生长达80%汇合时传代。
1.2.2 有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞 取对数生长期的第1代细胞，调整细胞密度至每毫升10～15个，吹打混匀接种于96孔培养板中，每孔100 μL，培养12 h后标记单个细胞孔，并补液至每孔200 μL，5 d换液，待克隆长至孔底1/3～1/2后0.25%胰蛋白酶消化，扩大培养。
1.2.3 免疫细胞化学鉴定牙周膜干细胞 取第2代克隆形成细胞进行爬片，正常山羊血清封闭液室温孵育30 min后分别滴加鼠抗人波形蛋白（1∶400）、鼠抗人角蛋白（1∶400）、鼠抗人CD146（1∶500）、鼠抗人STRO-1（1∶400）一抗，以PBS代替一抗作为阴性对照，4 ℃孵育过夜。次日在37 ℃复温1 h, 采用SP法检测波形蛋白和角蛋白的表达，同时利用FITC荧光标记二抗检测STRO-1和细胞分化抗原CD146的表达。
1.2.4 体外诱导分化 取第2代对数生长期的克隆形成细胞，按每毫升5×l03个接种于预先加入盖玻片的24孔板中，待细胞进入对数生长期后弃去原培养液，PBS洗3次，加入含质量浓度为10 μg/L的bFGF预诱导液培养，24 h后更换为含浓度为5 mmol/L的β-ME诱导培养液，每隔1 h倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，诱导培养6 h。对照组细胞常规培养。
1.2.5 免疫荧光检测神经细胞特异性抗原表达 诱导培养6 h后，弃去诱导培养液，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，正常山羊血清封闭液室温孵育30 min后分别滴加一抗NSE（1∶50）、NF（1∶50）、GFAP（1∶50），4 ℃过夜；次日37 ℃复温1 h后加入FITC荧光标记二抗，避光孵育30 min，甘油封片。
1.2.6 RT－PCR检测神经细胞特异性基因表达 收集诱导培养6 h后的细胞，使用细胞总RNA提取试剂盒提取培养细胞总RNA，采用一步法进行RT-PCR反应，以β-actin为内参照。参照GeneBank数据库，采用Oligo计算机软件设计引物，β-actin上游引物5′-GCGAGAAGATGACCCAGATCATGTT-3′，下游引物5′-GCTTCTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′；NSE上游引物5′-CGTTATTGGCATGGATGTTG-3′，下游引物5′－CCAGGTCAGCAATGAATGTG－3′；NF上游引物5′－ACACAGGCCGCTGGAATG-3′，下游引物5′－ACAAATTTTTTTCAGCAGC－3′；GFAP上游引物5′-GCTTCCTGGAACAGCAAAAC－3′，下游引物5′-GGCTTCATCTGCTTCCTGTC－3′；所有引物皆由上海生工生物技术公司合成。反应条件：50 ℃ 30 min逆转录，94 ℃ 5 min逆转录失活，然后94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环，72 ℃延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测，鉴定PCR产物片段大小。
2 结果
2.1 牙周膜干细胞的分离及纯化
本实验采用酶解组织块法培养原代细胞，3～10 d组织块周围有细胞爬出，2周左右可达80％汇合，有限稀释法筛选出来的细胞克隆呈圆形、多角形等多种形态，但都表现为胞核聚集在中心，胞质形成的突起向外呈放射状，具有成体干细胞的特征。
2.2 牙周膜干细胞的鉴定
免疫细胞化学检查发现，牙周膜干细胞角蛋白阴性表达，波形蛋白阳性表达（图1），说明本实验克隆化细胞为中胚层来源的间充质细胞且无外胚层来源的细胞污染。免疫荧光检测可见克隆细胞STRO-1、CD146均呈阳性表达，细胞发出明亮的绿色荧光（图2、3），说明其具有干细胞特性。
2.3 诱导后细胞的形态变化
倒置相差显微镜下观察发现，部分细胞体积缩小，立体感增强。加入诱导液后细胞形态急速向具有神经元特点的细胞转化，表现为胞体收缩成锥形、三角形或不规则形，折光性强，细胞伸出细长突起，部分细胞突起与突起间互相连接，呈现出神经元样细胞形态（图4）。
2.4 免疫荧光检测神经元细胞特异性蛋白表达
2.5 RT-PCR产物凝胶电泳分析
诱导细胞在430、230 bp处可见特异性扩增条带（图7），对照组未见条带。
3 讨论
成体干细胞是近年来干细胞领域研究的新热点,目前已经证明在机体许多成熟组织器官中存在成体干细胞。但在口腔医学领域，以往的研究仅仅认为牙周膜干细胞具有多向分化的潜能，即可分化形成自身纤维结缔组织的成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞，但并没有提出PDLSC的概念。2004年，Seo等[5]最早对人PDLSC进行了研究，从人牙周组织中分离出的克隆形成细胞具有向成牙骨质细胞及脂肪细胞分化的能力，首次证明了PDLSC的存在。干细胞自我更新能力在体内表现为可增殖形成组织并维持自身数量，体外则表现为成克隆性生长[6]，因而克隆化培养既是分离干细胞的方法，也是鉴定干细胞的手段之一。STRO-1是由CD34+骨髓细胞免疫的杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体，CD146是一种细胞分化抗原，二者均在未成熟细胞上有高水平的表达，但当其他分化抗原或细胞功能性标志物出现时，它们的水平明显下降，说明二者均为干细胞分化早期的标记物。本实验从成体人牙周组织中获得的单克隆细胞不仅具有克隆形成能力，而且STRO－1和CD146均呈阳性表达，初步表明了其干细胞特性。但是在牙髓干细胞和骨髓基质干细胞中二者也呈阳性表达，因此，还需进一步研究来寻找牙周膜干细胞的特异性表面标记物。
以往的实验证实，骨髓基质干细胞在体外一定条件下经过培养和诱导分化后表达神经细胞的特异性抗原，可定向分化为神经元细胞、胶质细胞[7]和神经膜细胞[8]，人牙髓干细胞体外一定诱导条件下也可以诱导形成神经细胞[9]。细胞的定向诱导分化受周围环境因素影响，如细胞质对细胞核的影响，相邻细胞的相互作用以及细胞外环境等都可调节细胞的定向分化。近年来的研究表明，成体干细胞的分化是通过一系列信号转导途径实现的[10-11]，转录因子调节多种基因的活性状态及决定细胞的分化通路，各种神经营养因子和细胞因子联合作用影响干细胞的增殖和分化。bFGF是一种能广泛促进来源于中胚层和神经外胚层细胞增殖的生物活性物质，许多研究证实bFGF可促进牙周膜细胞的增殖，抑制细胞的分化成熟，增加未分化的多能干细胞的数量[12]；同时有诱导神经干细胞向神经元细胞分化的作用，并可维持神经元细胞和神经胶质细胞的存活。本实验先用含10 μg/L的bFGF培养液预诱导24 h，再用含5 mmol/L的β-ME培养液诱导培养6 h，成功实现了PDLSC向神经元样细胞的定向诱导分化。
