转基因番茄防龋疫苗的基础研究
Ⅰ.变形链球菌pac基因唾液粘附区植物表达质粒的构建
［摘要］ 目的：构建变形链球菌表面蛋白基因（pac）唾液粘附区的植物表达质粒pROP1和pRPB1。方法：用PCR扩增的含变形链球菌表面蛋白唾液粘附区P1片段（184－1946bp）与植物的高效表达质粒pROKCP结合，构建pROP1表达质粒；且将此质粒与Bar基因（抗除草剂基因）连接，构建表达质粒pRPB1，酶切电泳检测。结果：从pPC41中扩增的P1片段整合到pROKCP的适当部位，构成重组质粒pROP1,从pPBar分离出的Bar基因整合到pROP1，构成重组质粒pRPB1。结论：本实验成功地构建了携带变形链球菌表面蛋白唾液粘附区的植物表达质粒pROP1和pRPB1。
［关键词］ 植物表达质粒； 表面蛋白基因； 唾液粘附区
转基因植物技术是随DNA重组、基因的遗传转化、植物的组织培养、目的基因的整合与表达的检测等技术手段的建立而发展起来的生物技术。本研究是将变形链球菌表面蛋白基因唾液粘附区(saliva-binding region, SBR)与植物的高效表达质粒相连接，以番茄作为生物反应器来表达表面蛋白抗原的唾液粘附区。
材料与方法
1. 质粒与菌种。pROCP质粒（Kmr）、pPBar质粒（Kmr）、大肠杆菌TOP10、大肠杆菌DH5а由中山大学生命科学学院生物工程中心惠赠。pPC41 质粒由美国Okahashi教授惠赠。pGEM-T easy 载体 （Ampr）购于美国Promega公司。大肠杆菌常规于Luria
-Bertani肉汤或琼脂中生长，根据所含质粒的耐药性在培养基中加适量抗生素。
2. 试剂与引物。Wizard PCR纯化试剂盒购于美国Promega公司，DNA 凝胶纯化试剂盒购于美国Sigma公司。其余化学纯试剂由实验室提供。引物由上海生物工程中心合成。引物1：5′gga tcc cag att tgg agg att tat gaa agt c 3′, 引物2: 5′ggt acc tca acc agc cag ctt tat cac c 3′。
3. DNA操纵。采用梯度PCR仪扩增P1片段，产物用Wizard PCR纯化试剂盒回收。PCR产物与pGEM-T easy载体连接形成pTP1质粒，连接酶与连接缓冲液由厂商配制。利用α互补现象和小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析筛选阳性克隆。从大肠杆菌中提取质粒按碱裂解法（1）。DNA定量采用紫外分光法。限制性内切酶酶切根据厂家说明选用缓冲液。DNA电泳用0.8 %琼脂糖凝胶电泳，从0.8%琼脂糖凝胶中提取目的DNA片段采用Sigma DNA 凝胶纯化试剂盒。DNA片段粘端连接采用T4 DNA连接酶，连接缓冲液按厂商要求配制。线状质粒DNA的去磷酸化采用Sambrook（1）等法。连接产物于4℃下过夜。
4. 转化。感受态大肠杆菌按氯化钙制备，制备后于-70℃保存。用前缓慢解冻，立即使用。大肠杆菌转化按热刺激法［1］进行。根据细菌耐药性挑选重组质粒。
结 果
一、PCR 扩增唾液粘接区P1片段及产物纯化结果
利用合成引物1和引物2在设立的各项参数下扩增P1片段，电泳检测只见一条1.76kb 的DNA带，本实验以HindⅢ、EcoRⅠ双酶切Marker作对照检测片段的大小及紫外分光法测定DNA的浓度约200ng/ul。PCR扩增的片段经PCR纯化试剂盒回收符合克隆条件。（图1）
图1 唾液粘附区基因的PCR扩增产物
A HindⅢ/EcoRⅠMarker
B 唾液粘附区基因的PCR扩增产物
图2 pROP1和pRPB1质粒的构建
A pROP1质粒BamHⅠ和KpnⅠ酶切片段
B pRPB1质粒HindⅢ酶切片段
C HindⅢ/EcoRⅠMarker
二、pROP1和pRPB1质粒的构建
pTP1用BamHⅠ和KpnⅠ酶切，分离纯化P1片段（1.76kb），将其与经BamHⅠ和KpnⅠ消化后的pROKCP连接，重组质粒为pROP1。pPBar质粒经HindⅢ消化，分离提纯Bar基因（3 kb），将Bar基因与经HindⅢ消化且去磷酸化的pROP1连接，重组质粒为pRPB1。酶切鉴定pROP1和pRPB1（图2）。pROP1质粒用BamHⅠ和KpnⅠ消化后电泳检测有两条带分别是6 kb和1.76 kb，pRPB1质粒用HindⅢ消化后电泳检测有两条带分别是7.76 kb和3 kb.
