变形链球菌和远缘链球菌耐氟菌株粘附能力的体外研究

1970-1-1 08:01  来源:上海口腔医学 2008-6-5 15:58:26
作者:盛江筠 阅读量:2368

[摘要] 目的 探讨变形链球菌和远缘链球菌耐氟突变后,其粘附能力的改变。方法 用同位素标记方法测定变形链球菌、远缘链球菌亲代及耐氟菌株粘附至唾液包被羟基磷灰石(SHA)表面的粘附量及粘附百分率,并比较两者的粘附能力。结果 变形链球菌、远缘链球菌亲代菌株与耐氟菌株间粘附百分率无明显差异(P>0.05);远缘链球菌与变形链球菌相比,其粘附百分率偏低,差异有显著性(P<0.01)。结论 变形链球菌与远缘链球菌耐氟菌株粘附至SHA表面的能力与亲代野生株无明显区别,提示耐氟菌株的产生不会降低变链菌的致龋性。
[关键词] 变形链球菌;远缘链球菌;耐氟菌株;粘附力

   龋病学研究证明,龋病是菌斑在牙面聚集而引起的感染性疾病,而细菌对牙面粘附为其在宿主定居的第一步。变形链球菌及远缘链球菌为人类及动物龋病主要致龋病菌,其高致龋力与其对牙面高度选择性和高亲和力密切相关。
  氟化物应用于龋病防治已有半个多世纪的历史,长期广泛应用氟制剂可能会导致变链菌耐氟菌株的产生[1,2]。为探讨变链菌耐氟突变后其粘附能力的变化,本实验采用全唾液包被的羟磷灰石颗粒(saliva-coated hydroxyapatite,SHA)及同位素标记方法,检测耐氟菌株粘附能力,并与亲代野生株进行比较。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基
  本实验所用菌株如表1所示,所用培养基为乳酪消化大豆胨肉汤(TSB)。

表1 本实验所用菌株
Tab.1 Bacteria strains used in this experiment
 

       亲代菌株耐氟菌株*
S.mutans Ingbritt(变形链球菌,国际参考株)Ingbritt-FR
S.sobrinus 6715(远缘链球菌,国际参考株)6715-FR
SSMU-M1( 变形链球菌,本实验室临床分离株)M1-FR
SSMU-S1(远缘链球菌,本实验室临床分离株)S1-FR

*耐氟菌株为亲代菌株在含有不同浓度NaF的乳酪消化大豆胨琼脂(TSA)培养基上经逐步诱导法获得,其最大氟耐受水平为1000μg/ml NaF。
1.2 粘附实验
1.2.1 唾液包被羟磷灰石颗粒SHA的制备 取一健康成人无刺激性全唾液20ml,4℃, 10 000r/min 离心10min, 收集上清, 60℃水浴30min灭菌,-20℃贮存备用。
  电子精密天平 (ER-182A, Japan)准确称取颗粒型羟基磷灰石10mg(上海生物材料研究测试中心提供),置于1.5ml Eppendorf管中,高压灭菌。每管中加入已高压灭菌的KCl缓冲液200μl(0.05mol/L KCl缓冲液,pH6.0) 37℃水浴平衡过夜。次日倾去缓冲液,每管中加入已制备好的唾液上清液200μl,37℃,6 r/min旋转2h,倾去唾液,用200μl KCl 缓冲液洗3次,加入200μl含有5mg/ml小牛血清白蛋白(BSA)的KCl 缓冲液,6 r/min旋转30min, KCL 缓冲液洗3次,吸干缓冲液,即制成唾液包被羟磷灰石SHA。
1.2.2 菌液制备 将复苏48h的变形链球菌及耐氟菌株(共8 种)于TSB中,37℃微需氧培养18h(95%N2,5%CO2), 转种于7ml含370kBq/ml 3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TDR)(中国科学院上海原子核研究所提供)的TSB培养基中,微需氧培养18h, 离心收集细菌,用0.05mol/L KCl缓冲液洗3次,再悬于含5mg/ml BSA的KCL缓冲液中,540nm调吸光度ABS为0.5, 备用。
1.2.3 粘附实验 将标记有 3H-TDR的细菌悬液200μl加到含有10mg SHA的Eppendorf管中,37℃, 6 r/min 旋转1h,KCl缓冲液洗3次,60℃烘干过夜。将Eppendorf管中加入1ml闪烁液(0.4%PPO) ,液体闪烁测量仪(LS6500, Beckman 公司)计数测量同位数放射量CPM。另取200μl 3H-TDR标记菌悬液,60℃烘干过夜后,直接加入1ml闪烁液,作阳性对照;以不加细菌的SHA,与实验组进行相同实验步骤,以KCl缓冲液代替菌悬液,作为阴性对照。实验重复2次,取均值,并计算细菌粘附百分率。

2 结果

  变形链球菌耐氟菌株与其亲代野生株对SHA粘附情况见表2。

表2 变形链球菌耐氟菌株对SHA粘附量及粘附百分率(±s)

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编辑: 姚红祥

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