［摘要］ 目的 制备粘放菌5951Ⅱ型菌毛兔抗血清。方法 采用物理、化学方法提纯Ⅱ型菌毛，多途径免疫制备兔抗血清，双向免疫扩散法鉴定兔抗血清。结果 提纯的Ⅱ型菌毛分子质量主要为34ku，多途径免疫后效价可达1:64。结论 粘放菌5951Ⅱ型菌毛蛋白分子质量为34ku，抗体效价为1∶64，与Ⅰ型菌毛间有轻度交叉反应。
［关键词］ 粘性放线菌；Ⅱ型菌毛；免疫
粘性放线菌（简称粘放菌）是牙菌斑的主要成员之一。已有的研究表明：粘放菌Ⅱ型菌毛作为粘放菌致病的毒力因子之一，在细菌早期定殖牙面、细菌间凝集及菌斑形成中起着重要作用。而抗菌毛抗体则能阻止粘附、凝集过程［1］，从而阻止菌斑形成，防止龋病和牙龈病。本实验在分离、鉴定粘放菌Ⅱ型菌毛的基础上，制备抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗体，为更深入研究粘放菌Ⅱ型菌毛的作用机制，开展龋病、牙龈病的预防提供手段。
1 材料与方法
1．1 粘放菌5951Ⅱ型菌毛的提取与鉴定
1．1．1 细菌培养与菌毛提取 将粘放菌变异株5951（只含Ⅱ型菌毛）经鉴定后接种于双倍浓度TSB液体培养基中，微需氧培养48h。经离心、生理盐水反复清洗3次，收集细菌沉淀物。通过超声粉碎、低温高速离心（48300r/min，20min，4℃）后，取上清液低温高速离心（160000r/min，24h，4℃）。沉淀物再以0.01mol/L PBS(pH7.0)溶解，反复超声、离心(12000r/min，20min，4℃)，收集上清液置于过饱和硫酸铵溶液(pH7.0)沉淀，4℃过夜。再离心，取沉淀物以0.01mol/L PBS溶解，经透析、浓缩获得菌毛初提物。
1.1.2 Ⅱ型菌毛纯化 将初提物通过Sephendex G100柱层析纯化。洗脱液为0.01mol/L PBS(pH7.0)，洗脱速度1.5ml/min，以自动收集仪收集。各管在日立UV-3100紫外分光光度计上测OD280值，绘制曲线，合并收集各管菌毛蛋白。透析、浓缩后备用。
1． 1.3 Ⅱ型菌毛鉴定 透射电镜观察菌毛初提物作初步鉴定。再采用SDS-PAGE电泳测定初提物与纯化菌毛的分子质量，以进一步证实为粘放菌Ⅱ型菌毛。SDS-PAGE电泳为3.5%浓缩胶，12%分离胶，上样量10-15μl，电极缓冲液pH 8.3。采用不连续电泳，电流为浓缩胶20mA，分离胶30mA，3h后结束电泳，凝胶置考马斯蓝中染色。
1.2 兔抗血清的制备与鉴定
1.2.1 免疫动物 选用体重2kg左右的新西兰雄性家兔作为免疫动物。
1.2.2 免疫抗原制备 在上述经鉴定的纯化Ⅱ型菌毛中加入等量完全福氏佐剂，配制过程中逐滴加入，不停搅拌至完全乳化。
1.2.3 免疫途径 采用多途径免疫方法。首次于家兔两后趾掌皮下注射福氏完全佐剂免疫抗原1.0ml，2周后于月国后肿大的淋巴结内注射抗原1.0ml，隔2周后在兔背部两侧皮下多点注射抗原2ml,14d后加强注射一次，再观察10d后于兔耳静脉抽血测试效价。达满意后，兔颈动脉放血，分离血清，-20℃保存。
1.2.4 兔抗血清鉴定 采用双向免疫扩散法。以纯化的粘放菌5951Ⅱ型菌毛作抗原，与浓度为1∶2-1∶64的相应兔抗血清进行常规双向琼脂扩散。
2 结果
菌毛初提物经透射电镜观察，证实确有菌毛存在后，以Sephendex G100凝胶柱层析纯化。结果显示：OD280值曲线呈现1个尖耸的第Ⅰ峰与2个低平的第Ⅱ、Ⅲ峰。SDS-PAGE电泳分析表明：上柱前的粘放菌5951Ⅱ型菌毛蛋白分子质量主要集中于34ku与47ku，同时夹杂有较多的其他蛋白质(图1)。上柱分离后，仅第Ⅰ峰出现清晰的蛋白质条带，其中杂蛋白明显减少，蛋白质分子质量集中于34ku(图2)。
收集的兔抗血清经双向免疫扩散，结果显示：多途径免疫后的兔抗Ⅱ型菌毛抗血清效价达1:64，其中1∶2与1∶4可见2条沉淀线(图3)。
图1 粘放菌5951Ⅱ型菌毛Sephendex G100柱层析前SDS-PAGE电泳
A、B粘放菌5951Ⅱ型菌毛初提物;C标准蛋白质
Fig.1 SDS-PAGE of type II fimbriae of A.v.5951 before chromatography of Sephendex G100
