厌氧菌代谢酸产物的气相色谱分析

1970-1-1 08:01  来源:上海口腔医学 2008-6-5 16:15:38
作者:顾淑萍 阅读量:2040

[摘 要] 目的 探讨厌氧菌代谢有机酸色谱分析法的可靠性,为大量的临床分离的厌氧菌鉴定提供可靠方法。方法 利用气相色谱法对6种厌氧菌的国际参考菌株的代谢有机酸进行了定性定量测定。结果 60株细菌中,有48株细菌测到所有代谢有机酸,10株细菌测到主要代谢有机酸,2株细菌测到不应有的代谢有机酸,总符合率为97.67%。结论 代谢有机酸色谱分析法鉴定厌氧菌是一种可靠的方法。
[关键词] 厌氧菌;有机酸;气相色谱

  厌氧菌因其生长缓慢、多数生化反应不活跃,用常规生化鉴定常有误差,而厌氧菌的代谢产物中常有特异的有机酸,故在厌氧菌的鉴定上已引入了代谢产物的定性定量测定,从而使其鉴定更加可靠。本实验对6种厌氧菌的代谢有机酸进行了检测和分析,以检验色谱法代谢产物测定的准确性,为鉴定临床分离的厌氧菌提供可靠的方法。

1 材料和方法

1.1 细菌及其培养
  本实验所采用的6种厌氧菌为乳杆菌ATCC4646、粘放菌ATCC19246、韦荣菌SSMU2041、产黑色素类杆菌ATCC1312、核梭杆菌F11和消化链球菌ATCC27337(均由上海市口腔医学研究所龋病室提供)。将上述6种细菌(均为国际参考菌株)(每种10株)接种于厌氧菌液体培养基(卫生部上海生物制品研究所提供)37℃厌氧培养72h后,涂片检查并作生化试验鉴定为纯菌株后,调细菌A值(721分光光度计,上海第三分析仪器厂)为1,接种100μl于10ml PYG液体培养基中,37℃厌氧培养72h(对生长慢的细菌培养时间延长至7d)后,提取代谢有机酸产物。
1.2 标准有机酸配制
  所用标准有机酸为色谱纯,均系上海化学试剂总厂生产。
  挥发性有机酸:乙酸0.057ml,异戊酸0.109ml,丙酸0.075ml,戊酸0.109ml,已丁酸0.093ml,异己酸0.126ml,丁酸0.092ml,己酸0.125ml。以上试剂加蒸馏水至100ml,其中各酸的含量为10mmol/L。
  非挥发性有机酸 85%乳酸0.088ml,丙二酸0.104g,草酸0.126g,琥珀酸0.118g。以上试剂加蒸馏水至100ml,其中各酸的含量为10mmol/L。
1.3 提取方法
  挥发性有机酸:吸取2ml培养物于一带塞小试管中,加50%硫酸0.2ml、乙醚1ml盖紧塞子,来回倒转20次,使乙醚和培养物充分混匀,1000r/min离心10min,置试管于-20℃冰箱至试管底部水结冰,迅速倒出乙醚于另一试管,取1μl作色谱分析。
  非挥发性有机酸:吸取1ml培养物于一带塞小试管中,加50%硫酸0.4ml、甲醇2ml盖紧塞子,55℃水浴过夜,取出试管加蒸馏水1ml、氯仿0.5ml,来回倒转20次充分混匀,1000r/min离心10min,吸取底部氯仿层1μl作色谱分析。
  标准酸和空白培养基也用同样方法进行提取,取1μl作色谱分析。
1.4 色谱分析条件
  Autosystem GC Chromatograph气相色谱仪,氢火焰离子检测器,PE1200色谱分析工作站;色谱柱为:毛细管柱,柱长30m、内径0.25mm、内涂Carbowax 20mol/L,液膜厚0.25μm;进样器温度250℃,柱温230℃,FID温度280℃;载气为氮气,压力12.4psi,氢气∶空气为30∶340ml/min。每个样本分析时间为10min。
1.5 数据处理及谱图制作
  将样本注入进样器后,仪器自动采集数据并送到1200工作站积分处理并作出色谱图,其中记录各有机酸的出峰顺序、保留时间、峰高、峰面积百分比。将各菌株的谱图数据与标准酸的谱图数据输入电脑,并减去空白管的酸本底,算出各菌株的代谢有机酸产物的mmol值,以10mmol/L为标准定出主要酸产物(>10 mmol/L)和次要酸产物(<10 mmol/L)。参照Bergey系统微生物手册[1]和陈聪明[2]的鉴定方法,检测乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸、异己酸、己酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸。将各菌株的产酸谱与标准谱比较,得出符合率。

2 结果

  除核梭杆菌中的次要酸产物丙酸未检出外,其它所有细菌的主要和次要酸产物均检测到,其含量见表1。检测出的代谢酸含量基本与标准一致(表2),有两株乳杆菌检测到己酸。各菌株的主要代谢有机酸色谱图见图1-6。

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编辑: 姚红祥

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