【摘要】 目的 观察表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ的免疫原性和免疫反应性。方法 采用纯化的抗原Ⅰ/Ⅱ皮下注射免疫BALB/c小鼠，同时用变形链球菌全细胞皮下免疫小鼠作对照。结果 间接酶联免疫吸附实验结果表明：抗原Ⅰ/Ⅱ皮下免疫既能显著诱导血清中特异性抗抗原Ⅰ/Ⅱ-IgG抗体产生，又能显著诱导唾液中特异性抗抗原Ⅰ/Ⅱ-IgG抗体产生(P＜0.01)；而全细胞免疫只能诱导血清中IgG抗体产生(P＜0.05)。结论 本研究提示抗原Ⅰ/Ⅱ是一种有效的疫苗免疫原。
【关键词】 变形链球菌 表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ 免疫疗法 龋齿
龋病是一种细菌感染性疾病［1］。免疫防龋已被认为是控制龋病的有效手段之一［2，3］。大量研究结果表明，变形链球菌(以下简称变链菌)表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ(以下简称抗原Ⅰ/Ⅱ)是一种有效的候选抗原，其免疫原性强。国外已有学者进行了抗原Ⅰ/Ⅱ免疫动物的试验研究［4～7］，但用纯抗原Ⅰ/Ⅱ对小鼠进行全身免疫的观察国内外尚未见报道。本项研究用纯化的抗原Ⅰ/Ⅱ作为变链菌亚单位疫苗对 BALB/c小鼠进行皮下注射，观察其能否诱导唾液和血清中特异性保护抗体产生。
材料和方法
1.细菌：变链菌Ingbritt(血清c型)(美国Button Rosan教授惠赠)。
2.主要试剂：辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(华美生物工程公司)，邻苯二胺(OPD)(华美生物工程公司)；碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgA(Sigma公司)，对硝基苯磷酸酯(p-NPP)(华美生物工程公司)；完全福氏佐剂(Sigma公司)。
3.免疫原：
(1)纯化的变链菌表面蛋白质抗原Ⅰ/Ⅱ［8］。
(2)变链菌细胞悬液：用0.5%福尔马林生理盐水制成细胞悬液，1012CFU(cell forming unit)/L［4］。
4.实验动物及分组处理：湖北省医学科学院动物饲养中心的6～8周龄雄性BALB/c小鼠30只，实验动物为普通级(一级)合格，批号：19-006。 喂养BALB/c小鼠的实验动物环境为普通级(一级)合格，批号：19-002。
将BALB/c小鼠随机分成3组，每组10只。第一组：每只小鼠用100μg纯抗原Ⅰ/Ⅱ免疫。将抗原与完全福氏佐剂充分乳化后对小鼠脊柱两侧进行皮下多点免疫；2周后，用相同剂量的抗原与不完全福氏佐剂充分乳化后，对小鼠进行皮下追加免疫；一周后处死小鼠，收集唾液和血清。第二组：为实验对比组。用变链菌全细胞对BALB/c小鼠进行皮下免疫，其免疫剂量、免疫次数与第一组相同。每只小鼠用1ml细胞悬液(109CFU，其干重约100μg) 进行免疫。第三组：未免疫对照组。
5.唾液和血清的收集：每只小鼠腹腔注射毛果芸香碱(0.75mg/100g体重)，用Eppendorf管收集全唾液约300μl，离心、唾液样本置于-20℃保存。采用摘除小鼠眼球法收集血清，每只小鼠收集约600μl全血，室温下凝固，4℃下过夜，离心，血清样本置于-20℃保存。
6.间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测唾液和血清中抗体水平：纯化的抗原Ⅰ/Ⅱ溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液中(pH9.6)，包被聚苯乙烯微量酶标板，4℃下过夜，用含0.05%Tween20的磷酸盐缓冲液(PBST)充分洗涤。用3%牛血清白蛋白(BSA)封闭90分钟，PBST洗涤后加待测血清样本(1∶50稀释)和唾液样本(1∶20稀释)，37℃温育1小时，洗涤方法同上。分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG和碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgA，37℃温育4h ，PBST充分洗涤后分别加底物OPD和P-NPP显色，分别用酸碱中止反应后用516MC酶标仪测定每孔OD490nm和OD405 nm值。每个样本一式三份。
结果
1.血清中特异性抗抗原Ⅰ/Ⅱ抗体水平：ELISA结果表明：抗原Ⅰ/Ⅱ皮下免疫组血清中特异性抗抗原Ⅰ/Ⅱ-IgG抗体水平与对照组比较，差异有非常显著性(P＜0.01)；变链菌全细胞免疫组血清中抗抗原Ⅰ/Ⅱ -IgG抗体水平显著高于对照组(P＜0.05)；但血清中特异性抗抗原Ⅰ/Ⅱ-IgA抗体水平经方差分析，三组间在统计学上差异无显著性(P＞0.05)(表1)。
