〔摘要〕 目的：观察大鼠正畸牙齿移动中牙槽骨的细胞凋亡现象以及凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达，初步探讨细胞凋亡在牙槽骨改建中的作用。方法：选用25只健康雄性SD大鼠，用单簧圈别针簧矫治器推上颌切牙侧向移动，于加力后1、3、5、7 d系列观察牙槽骨中细胞凋亡及其相关基因Bcl-2和Bax的表达，以正常组为对照，用免疫组织化学方法和TUNEL法进行检测。结果：正常牙槽骨组织中存在凋亡细胞，主要见于骨细胞，呈散在性分布，数量较少。牙齿移动时，压力侧牙槽骨改建活跃，凋亡细胞有增多趋势，而张力侧牙槽骨凋亡细胞呈减少趋势。在成骨细胞、破骨细胞、透明性变区未检测到凋亡细胞。Bcl-2和 Bax在正常牙槽骨细胞均有表达，在压力侧Bax的表达强于Bcl-2，在成骨细胞和破骨细胞Bcl-2的表达强于Bax。结论：细胞凋亡及其相关基因Bcl-2和 Bax参与了正畸牙齿移动过程中牙槽骨的改建过程。
关键词 细胞凋亡；牙槽突；较少牙移动；基因表达
细胞凋亡(Apoptosis)是基因调控下的细胞主动的有序的死亡过程，又称程序性细胞死亡 （programmed cell death，PCD）， 它在个体发育和维持机体内环境稳定方面具有重要的生物学意义 〔2〕。有研究发现，细胞凋亡与人体许多部位的骨改建有密切关系〔2〕，但对细胞凋亡在正畸牙槽骨改建中的作用所知甚少。本研究初步探讨了正畸牙齿移动中牙槽骨改建与细胞凋亡的关系，以加深对正畸牙齿移动机理的认识。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
选用25只健康雄性SD大鼠（本校实验动物中心提供），体重(200±20) g，随机分为5组：正常对照组、牙齿移动1 d组、3 d组、5 d组、7 d组，每组5只。
1.2 大鼠正畸牙齿移动实验模型的建立
本实验采用大鼠上颌切牙为实验牙。大鼠经846液（0.20 ml/kg，长春动物研究所）肌注麻醉后仰卧固定，细金钢砂钻（登士伯公司）在上颌切牙牙颈部制备贯穿洞，采用0.4 mm直径的牙用不锈钢丝（陕西钢铁研究所医疗器材厂，第四军医大学口腔医学院）弯制单簧圈别针簧矫治器推切牙向两侧移动，小圈的直径为1.5 mm。用测力计（德国）测定其开大程度与力值间的关系，调节别针簧的开大程度，使作用于切牙的力值为0.19 N(20 g力)，将其双臂插入两切牙上所制备洞内，末端回弯以防止脱位。实验组大鼠分别于1、3、5、7 d麻醉下放血处死，40 g/L多聚甲醛固定液心内灌注，取材后放入40 g/L多聚甲醛固定液中再固定24 h，甲酸-甲酸钠溶液（Krinstensen脱钙液）脱钙1周，系列乙醇脱水，二甲苯置换至石蜡包埋。常规石蜡切片，厚度4 μm，行HE染色、免疫组化和TUNEL法检测。
1.3 免疫组化染色步骤
按照美国ZYMED公司SP免疫组化试剂盒的步骤操作：切片经二甲苯脱蜡后梯度酒精水化，用微波法进行抗原修复（0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液，pH6.0，微波炉加热至92～98 ℃之间并持续15 min），自然冷却后PBS洗3次，体积分数为3%H2O2消除内源性过氧化物酶的活性（37 ℃10 min），用体积分数为10%正常山羊血清封闭（37 ℃20 min）后分别滴加1∶50的Bcl-2和Bax兔抗大鼠一抗工作液（北京中山生物技术有限公司），4 ℃过夜后复温1 h，PBS洗5 min×3次，然后滴加1∶100的生物素标记二抗（北京中山生物技术有限公司）（37 ℃30 min），PBS洗5 min×3次，然后滴加1∶100的辣根酶标记链霉卵白素（北京中山生物技术有限公司）（37℃30 min），PBS洗5 min×3次，DAB显色剂（北京中山生物技术有限公司）显色20 min后终止反应，苏木精复染，脱水，透明，封片。阴性对照：用PBS代替一抗工作液。
1.4 TUNEL（Terminal dUTP-X Nick End Labeling）法标记凋亡细胞
按照德国Boehringer Mannhelm公司细胞凋亡试剂盒的步骤操作：切片脱蜡至水，滴加蛋白酶K（37 ℃30 min），PBS洗3次，加TUNEL反应液（37 ℃60 min），PBS洗3次，滴加标有碱性磷酸酶的抗荧光素抗体（37 ℃30 min），PBS洗3次，用NBT/BCIP显色20 min后PBS再洗3次，脱水，透明，封片。阳性对照：标记反应前用200 μg/L DNA酶（Sigma公司）处理切片。阴性对照：用标记液代替TUNEL反应液。
