【摘要】 目的 观察1，25二羟维生素D3［1，25( OH)2VD3］对培养兔骨髓细胞产生立即早期基因c-fos的蛋白产物(FOS蛋白)的诱导作用 。方法 在原代培养至第六代的兔骨髓细胞中加入含5×10-5M /L 1，25(OH)2VD3的培养液，继续培养3小时后，固定标本，进行FOS免疫组化反应。结果 大部分细胞形态正常，胞核呈棕黄色，椭圆形，胞浆不着色，细 胞轮廓清晰，表现为FOS免疫组织化学反应阳性。结论 1，25(OH) 2VD3能够诱导兔骨髓细胞表达FOS蛋白，提示它可能通过c-fos这条信号转导途径在骨组织 改建过程中发挥作用。
【关键词】 1，25二羟维生素D3 骨髓细胞 立即早期 基因c-fos
1，25二羟维生素D3［1，25(OH)2VD3］是维生素D3代谢衍 生物，是一种具有广泛生物效应的激素前体，是调节骨质代谢的中心环节。Beresford等 ［1］报道VD3是一种对成骨细胞生长、分化有重要作用的调节因子，可能对骨组织的 形成有直接的影响作用。本文利用FOS蛋白免疫组化方法观察了1，25(OH)2VD3对培养兔 骨髓细胞FOS蛋白产生的诱导作用。
材料和方法
1.材料：1，25(OH)2VD3(第四军医大学赵大为博士惠赠)，羊抗兔FOS血清( 北京中山生物技术公司)，生物素化IgG(Sigma),ABC复合物(Sigma),DMEM培养液(Gibco),FBS (浙江金华清湖犊牛利用研究所)，胰蛋白酶(上海浦东生化试剂厂)，CO2细胞培养箱(美国 Forma Scientific公司)，YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)，倒置显微镜及照相系统( Olympus),Triton-X100(华美生物工程公司)。
2.兔骨髓细胞的培养：出生1天的新西兰幼兔1只，断头处死，无菌条件下取四肢长骨，纵行 切开，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，轻轻吹打，静置1分钟，使大块组织沉降，取上清进行培 养。24小时后换液，去除未贴壁的血细胞，以后每3天换液1次，0.25%胰酶常规传代。 倒置显微镜下进行观察。
3.FOS免疫组织化学反应：将培养至第6代的骨髓细胞接种于放有载玻片的小培养皿内，待长 满后，在实验前一天换液。弃去原培养液，加入含5×10-5M/L 1，25(OH)2VD3的 培养液1ml，放入培养箱内3h后，将载玻片取出，0.01mol/L PBS冲洗5min后，用4%多聚 甲醛固定15min,将玻片放于0.3%Triton X-100,30min;0.01mol/L PBS冲洗3次，每 次10min；然后将切片入兔抗FOS血清(1：1000)，4℃，孵育48h；再入生物素化IgG(1:500), 4℃孵育12h；再放入ABC复合物(1：500)，4℃孵育12h。以上各步骤间均用0.01mol/L P BS(PG7.4)冲洗3次，每次10min。呈色反应前，用双蒸水漂洗5min，然后用DAB-H2O 2法呈色15min,Olympus BH2显微镜下观察，照相。对照组内加入不含1，25(OH)2VD3 的培养液，余过程同实验组，另取二张玻片固定后行ALP钙-钴法染色和HE染色。
结果
1.原代培养的骨髓细胞约24小时贴壁，细胞最初为长梭形，传代后体积逐渐变大 ，成为多边形。HE染色见细胞胞浆丰富，核圆形，居中，有2～3个清晰可见的核仁(图1)。A LP染色结果示约7%～8%的细胞ALP阳性，胞浆内可见黑色颗粒。
图1 显示骨髓细胞HE染色 ×20
2.FOS免疫组化结果显示，所有的细胞形态正常，胞核呈棕黄色，圆形，胞浆不着色，细胞 轮廓清晰，表现为FOS阳性反应(图2)。
图2 显示骨髓细胞FOS免疫组化阳性反应 ×20
3.对照组的FOS免疫组化结果显示，所有的细胞核均未着色，为FOS免疫组化阴性反应。
讨论
1，25(OH)2VD3是一类含类固醇的物质，它是维生素D(VD)的活性代谢产物 。近年来的研究发现，它能抑制细胞的增殖、诱导细胞的分化，被广泛应用于内分泌系统、 免疫系统、肿瘤等疾病的治疗［2］。1，25(OH)2VD3是通过其受体发挥生物学效 应的，其受体不仅分布于与骨、钙代谢有关的小肠、肾和骨等组织，还存在于脑、肝、皮肤 、牙齿等器官。1，25(OH)2VD3是调节小肠钙磷吸收的主要激素，能促进钙结合蛋白合 成，加速钙吸收。同时可增加破骨细胞的活性、促进骨钙吸收，从而在骨代谢与改建过程中 起重要作用。
