正畸治疗中龈下菌斑检测的研究进展

    随着人们对生活品质的要求和对口腔健康重视的程度逐渐提高，通过正畸治疗获得健康整齐的牙齿已经成为越来越多人的选择。自从1998年隐形矫治器问世以来，由于其与传统固定矫治器相比更加美观、舒适、便捷，且作为活动矫治器，患者可自行摘戴，便于口腔卫生清洁，因此越来越多的患者选择使用此类矫治器接受正畸治疗。
    然而，无论无托槽隐形矫治还是传统的固定矫治，都会引起口腔内环境发生变化，进而造成口腔细菌微生态的改变。正常情况下，口腔微生态中菌丛间的组成处于动态平衡。但当这一微妙平衡失衡时，可诱发多种口腔感染性疾病，包括龋病、牙髓根尖周病、牙周病、颌骨骨髓炎等，严重危及口腔健康，甚至全身健康。
    牙周炎是由牙菌斑中的微生物引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病，其始动因子为牙菌斑生物膜的细菌及其产物，而牙列不齐是重要的影响因素之一。通过监测牙周微生物的结构组成，可以达到预防疾病发生发展的目的，因此，了解正畸过程中龈下菌群的变化十分重要，因此本文将对目前正畸治疗中龈下细菌常用的检测方法及研究进展进行综述。
    1.刚果红染色
    刚果红染色法取菌斑与2%刚果红混合，经浓盐酸染色制成涂片，在显微镜下放大1000倍观察涂片并记数，按Listgarten分类计算检出率。该方法取样简单，可基于形态学简单计算各类细菌的百分比，但无法进行进一步分类，缺乏特异性，受染色技术、计数视野等限制。
    赵弘等随机选择了16名患者在固定矫治器使用的第1、3、5、8周进行龈下细菌的刚果红染色检测，发现球菌减少，螺旋体和梭状菌增多。周佳卉等观察了45例佩戴固定矫治器的患者菌斑情况，发现正畸后1、3个月时球菌、杆菌、弯曲菌比例较前均显著降低，梭状菌、螺旋体、丝状菌所占比例则显著增高。这可能是因为佩戴固定矫治器后口腔卫生变差、部分患者牙龈肿胀导致假性牙周袋形成，使得龈下菌群的结构发生了变化向致病型发展。
    2.BANA检测
    BANA（微生物酶促N-苯甲酰基-DL精氨酸-2-萘酰胺）测试是通过检测三种牙周病高度相关病原体-Pg，Td和Tf的酶样蛋白酶代谢产物来检测是否存在牙周感染的方法。该试剂对光和湿度敏感，每次抽出条带使用时需密封。将菌斑样本涂在固定在测试条的试剂基质上再进行处理，若纸条变色则说明存在该牙周病原体。此方法相对简单、迅速，价格低廉，但缺点是无法区分细菌种属，不能进行定量分析。
    Karkhanechi等采用BANA实验法评估了使用固定矫治器和可摘隐形矫治器的成人牙周状况，发现6周时隐形组和固定组差异不大，但6、12个月时，固定矫治器组BANA评分更高。由此提示在初期阶段，两种矫治器的戴入均影响了口腔菌群的平衡，并且粘接在牙齿上的附件和托槽使得菌斑更易聚集。但长期来看，可摘戴的矫治器更易于口腔卫生维护，更有利于牙周健康。
    3.细菌培养
    细菌培养方法是将取得的临床标本稀释接种于选择性或非选择性培养基中培养，再根据各种细菌的特性，如观察培养菌落的形态、染色性、糖酵解、分析代谢终产物等来区分不同细菌种类的方法。该方法的优点是可以进行定量分析，且分离出的细菌可以用来进行后期的实验。但也仍有许多不足之处，首先是细菌培养周期过长；其次是只能检测活菌，因此受培养环境、操作人员技术敏感性的影响；除此之外，因龈下细菌含有大量厌氧菌，在目前条件下许多细菌难以被分离培养和检测。
    Paolantonio等用细菌培养技术检测了佩戴固定矫治器后前3个月患者的龈下微生物，显示Pg有所升高。Naranjo等同样检测了佩戴固定矫治器后3个月的患者的龈下微生物，显示Pg、Pi、Fn的检出率均有所升高。巴登高娃等对比了正畸患者与健康人群的龈下细菌组成，显示在第1月Pg、Fn、Tf、Aa检出率显著升高，第3个月时虽然高于基线，但相比1月有所降低。
    Ristic等检查了佩戴固定矫治器1、3、6个月后的患者龈下细菌的检出率，发现细菌总数和Pi在戴入矫治器前3个月有所增加，在6个月时有所下降。说明佩戴矫治器初期，患者的龈下致病菌升高较为普遍，可能是口腔环境的变化较大，卫生控制的难度增加有关。但随着时间发展致病菌又有所降低，可能是免疫细胞激活发挥了一定抑菌功能，伴随着患者口腔卫生意识的提高和对于牙龈炎症的控制与治疗，使得致病菌含量下降,并未对牙周造成不可逆的破坏。
    4.PCR检测
    PCR检测是利用已知DNA为模板，在聚合酶和核苷酸底物共同参与下，按照半保留复制的机制扩增的方法来获得足够的DNA进行分析和检测的方法。从最初的普通PCR技术逐渐发展，衍生出反转录PCR、多重PCR、单分子PCR等方法，目前实时荧光定量PCR较为常用，该技术是在反应体系中加入可以特异性标记产物的荧光物质,观测荧光信号的变化则可实时定量监测PCR过程。
    与传统PCR方法相比，实时荧光定量PCR自动化程度高，可一次检测大量样本；精度也有所提高，可以检测以个数计的细菌或细胞。但是由于定量PCR的扩增过程受多种因素影响，准确性仍然有待提高。
    石晶等利用实时荧光定量PCR技术观察了无托槽隐形矫治患者和固定矫治患者各15例，发现前3个月Pg隐形矫治组显著低于固定组。邓晓瑜等发现固定矫治器组的患者Pg在3月时增加并达到高峰，在6月时下降，与前文Ristic等的研究结果一致。而隐形组在数月中Pg占比无明显变化，Tf菌在两组患者的数月中并未明显检出。说明可能隐形矫治器更有利于牙周健康的维护，而且长期来看，佩戴任意一种矫治器并没有对牙周组织造成不可逆的损害。
    Abbate等对50名10~18岁的意大利青少年进行了隐形矫治器和固定矫治器随机对照实验，检测矫治前、矫治后3、6、12月患者Pg、Aa，Pi和Tf未发现阳性。这可能是因为该研究入组的患者在每次复诊前、治疗中都进行了严格的口腔卫生宣教，保持了较好的口腔卫生。
    韩俊等对47例进行牙周序列治疗的轻、中度牙周炎成人正畸患者的龈下细菌进行了检测，发现正畸治疗过程中、结束时牙菌斑中Pg、Fn、Tf、Aa检出率均较治疗前明显降低。这表明在牙周炎得以控制的情况下，对患牙施以适宜的矫治力的正畸治疗反而会改善其牙周状态。
    可能是因为患者在此过程中养成了更好的口腔卫生习惯，积极进行牙周检查和治疗，同时随着牙齿的排齐减少了咬合干扰、创伤、拥挤错位等，有助于细菌的控制。
    5.16SrRNA测序
    传统的微生物检测技术，往往是关注某种细菌的监测，而16SrRNA基因测序则从更深层次的结构和多样性分析微生物群落，是目前公认的较为准确的微生物鉴定方法。16SrRNA是原核生物的核糖体RNA，基因序列可分为8处高度保守的区域区和9处可变区，保守区为所有细菌所共有，可变区在不同细菌间存在差异，具有种属水平的特异性，因此可用于细菌种属的鉴定。
    16SrRNA基因大小适宜,一般含有5~10个拷贝，既符合快速测序的需求又含有足够多的信息位点，因此很适合检测低灵敏度的细菌。第一代测序最初使用的主要是变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、末端限制性酶切长度多态性等方法。此类技术根据碱基序列不同的分子解链行为不同或空间构相不同而导致在凝胶中迁移率不同的原理，得到不同变性浓度下获得的不同位置电泳条带。该方法可辨别群落中优势细菌，同时分析多个样品，多用于监测菌群结构和组成的变化。
    但该方法也有一些缺点：①受电泳条件限制对操作的技术敏感性较高；②不同批次数据难以进行比较；③敏感度随检测片段的长度增加而降低。1977年，Sanger发明了双脱氧核苷酸末端终止测序法，原理是使用引物对目的基因进行PCR扩增，建立产物克隆文库后对文库测序。此方法的优点是单次测序长度增加可达1000bp，最多能一次进行384个样本的测序，准确率高，获得的信息位量大。
    缺点在于存在退火偏差，且相比于后期出现的测序技术速度慢、成本高，且难以扩增样本中低含量的基因序列。因此主要用于检测产物中的优势菌，不适宜对菌群多样性进行分析。
    2006年第二代测序技术诞生，原理是通过解析新合成端的荧光信号来测定核酸序列。将引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下，检测引物上每一个dNTP的聚合与荧光信号的释放和强度，达到实时测量DNA序列的目的。
    第二代测序技术检测范围更广，具有高通量、快速、直观的特点。但是此类方法仍存在一些缺点，其一是测序长度相对较短，多数为150bp左右；其二是数据提取处理复杂，且费用较高。因此需慎重选择测序区，目前常用于微生物群落结构、生态功能的研究。
    2011年第三代测序技术即单分子实时测序技术诞生，该技术不需要经过PCR扩增，不依赖化学洗脱、荧光检测系统，实现了对每一条DNA分子的单独测序。其原理主要分为两类，一类是纳米孔测序，电泳驱动单分子通过纳米孔，通过其电信号的差异检测不同碱基；另一类是荧光标记脱氧核苷酸，其掺入DNA链时被检测，参与形成DNA化学键时再被聚合酶切除荧光基团，从而测定不同碱基。
    该技术不但可进行基因精确分型，还能实现对基因组复杂区域的组装、甚至是对某个基因内及等位基因间差异的细致解析。该方法基于DNA聚合酶内在的自身反应速度，直接检测基因序列，因而检测速度和精度大幅提高。目前主要应用于基因组测序、甲基化测序、突变鉴定等方向。
    目前应用16SrRNA基因测序分析正畸期间龈下微生物群落变化的研究相对较少。Koopman等检测发现戴用固定矫治器的青少年在正畸期间各项牙周相关致病菌微生物的检出率均有所增高，但正畸结束后的细菌组成与之前差别很小。Guo等对10名进行固定矫治的女性患者进行了16SrRNA检测，发现戴入矫治器前3个月龈下核心微生物组的丰度相对稳定，虽然Pi、Cr、Fn和Td均有增加，但结果没有显著差异。
    提示接受固定矫治器治疗后龈下微生物群落可能引起短暂的、轻度的牙龈炎症，但矫治结束后不会产生明显的负面影响。Guo等又对10名进行隐形矫治的女性患者龈沟液进行了16SrRNA的检测，发现戴用矫治器的前3个月，龈下菌斑微生物多样性略有下降，微生物结构发生变化，但5种牙周常见细菌-Aa、Pi、Cr、Fn和Td的水平相对稳定,且占比小于1%。说明隐形矫治器的戴入也会影响口腔细菌的结构，但该实验样本量较小，性别单一且时间较短，仍需要更大样本量、长期的实验来验证这一结论。
    综上所述，以往正畸治疗中牙周致病菌的监测技术主要采用刚果红负性染色涂片法、细菌酶学检测法、牙周致病菌培养法、传统PCR、荧光定量PCR技术等，但由于技术的限制，研究多数停留在传统牙周病相关的几大类细菌的检测，结果也并不完全相同。
    随着科学技术的发展，以DNA为基础的一系列分子研究方法如16SrRNA测序技术的兴起，使研究者不再局限于已知的标志性细菌，而是可以在结构复杂性和基因多态性的层面更清晰地研究和了解人体微生物菌群。目前该技术在正畸治疗中的龈下菌落变化的应用依然较少，但可以预见，随着对口腔微生物组环境的重视和测序技术的不断发展，正畸治疗中的微生物、微环境变化的研究也将进一步深入，更加有利于开展个性化的正畸治疗及促进精准化的口腔卫生保健。