抗菌十肽KSL的抗菌能力及其在口腔医学中的应用

2017-4-19 09:04  来源:中华口腔医学研究杂志(电子版)
作者:谭易 古丽莎 阅读量:1113

    近年来,由于抗生素滥用,耐药菌感染所致疾病已成为临床治疗的重点和难点。抗菌肽作为一种广泛存在于生物体内的小分子多肽,具有抗菌谱广,抗菌效能高且不易产生耐药性等特点。其不仅能杀灭细菌,而且对正常细胞毒性较小,生物安全性高。研究显示,抗菌肽能在口腔内形成化学屏障,阻止病原菌入侵,抑制口腔内生物膜形成,减少龋病和牙周病的发生。然而,天然抗菌肽抗菌活性相对较低,且容易水解,用于体内时稳定性不佳。

    为了弥补天然抗菌肽的这些缺点,保留并优化抗菌肽的有利特性,Hong等通过氨基酸的多肽组合文库,设计合成简单序列的小分子抗菌肽,为新型抗菌肽的研发应用提供了巨大帮助,其中抗菌十肽KSL(KKVVFKVKFK-NH2)是根据天然抗菌肽的特性合成的具有较强抑菌性能的新型抗菌肽。其不仅具备天然抗菌肽广谱性和高效性等特点,而且分子量小、成本低,组织毒性小,不易导致口腔菌群失调及不易产生耐药性等优势,具有良好的应用潜能。本文主要对抗菌十肽KSL的结构、特性及其在口腔医学中的应用和前景作一综述。

    一、KSL的基本结构及特点

    抗菌肽的家族成员十分庞大,目前已知从各种生物体内分离鉴定的抗菌肽超过900种。天然抗菌肽是由12~60个氨基酸组成的小分子阳离子多肽,由于富含赖氨酸、精氨酸和组氨酸等碱性氨基酸,抗菌肽通常带有2~7个正电荷,等电点大于7,表现出较强的阳离子特性。KSL作为一种新型人工合成多肽,具有独特氨基酸序列。其一级结构为Lys-Lys-Val-Val-Phe-Lys-Val-Lys-Phe-Lys-NH2,其中Lys(赖氨酸)是阳离子氨基酸,为多肽提供正电荷,脂肪氨基酸Val(缬氨酸)有利于多肽二级结构的形成,芳香族氨基酸Phe(苯丙氨酸)能提高多肽合成的效率级产物的稳定性。

    KSL分子中的5个赖氨酸残基分布在亲水侧,3个缬氨酸残基分布在疏水侧,整个分子共有6个正电荷,其中阳离子氨基酸位置相对分散,通过形成6个分子内氢键,维持单股稳定的α-螺旋结构。然而,KSL的稳定性较差,在唾液中肽键Lys6-Val7和肽键Phe5-Lys6容易断裂,导致多肽降解。Na等将Lys6氨基酸残基甲基化、Trp替换Lys6或以右旋Lys替换Lys6等方法,合成KSL-M、KSL-W、KSL-D三种KSL的类似物,并通过实验证实几种多肽在唾液中稳定性KSL-D>KSL-W>KSL-M>KSL。在人工胃液中KSL-D 稳定但失去抑菌活性,而KSL-W在胃液中发生明显的降解但仍能保持抑菌活性。

    二、KSL的抗菌机制

    目前认为,阳离子抗菌肽主要通过自身两亲性结构作用于细菌的细胞膜,通过带负电荷的疏水区域与胞膜脂质结合形成跨膜离子通道,带正电荷的亲水性区域与水或带负电荷的残基结合,使细胞膜穿孔,破坏细胞膜的完整性,导致细胞质外溢而达到杀菌的目的。因此,形成跨膜离子通道能力的强弱是决定抗菌肽抗菌活性的关键因素。由于阳离子抗菌肽接触细菌时没有特异性作用靶位,所以其对耐药细菌也具有抑菌作用,且不易诱导新的耐药性产生。

    此外,抗菌肽还存在胞内杀菌作用,主要作用机制包括:(1)引起胞内物质的絮凝反应;(2)抑制细胞壁生成;(3)与核酸物质相结合;(4)抑制核酸或蛋白质合成;(5)抑制酶的活性;(6)改变细胞膜,抑制隔膜形成。尽管Concannon等发现经KSL处理后的唾液乳酸杆菌、变异链球菌、放线杆菌等样本出现明显的死亡细菌聚集物。但相较于其他多肽,KSL不具备典型完整的两亲性结构特征,难以自发嵌入胞膜形成跨膜离子通道。他们在实验中同时还发现KSL在二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液(即类似极性膜环境)中能保持稳定的α-螺旋结构,这有利于KSL与细菌包膜的相互结合作用。

    目前认为,虽然KSL不具有典型的两亲性结构,但其可以通过带正电荷的氨基酸残基与G+菌细胞膜上的磷壁酸(teichoic acid,TA)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)、赖氨酰磷脂酰甘油(lysyl-phosphati-dylglycerol,lLPG),或与G-菌细胞膜上脂多糖(lipopolysac-charide,LPS)的负电荷通过静电吸附结合于细胞的磷脂膜上,进而牵引整个分子进入质膜,导致细菌胞膜功能紊乱和破坏。穿过细胞膜的KSL亦可能在细胞内积聚,通过细胞内杀菌作用干扰胞质正常功能,从而抑制细菌活动,导致细菌死亡。此外,研究亦证实KSL和KSL-W对白假丝酵母菌等真菌具有明显的抑制作用。

    三、KSL及其类似物在口腔医学中的应用

    天然抗菌肽存在诸多局限性,如:(1)抗菌活性较传统抗菌剂低,作为抗菌剂使用需要剂量大,应用成本高;(2)抗菌活性与肽链长度正相关,抗菌活性强的抗菌肽肽链较长,合成成本和免疫原性亦较高;(3)导致真核细胞溶血性破坏;(4)体内易降解;(5)抗菌机理尚不明确等。通过分子生物技术人工合成的抗菌肽KSL及其类似物,肽链中仅有10个氨基酸,因此免疫原性及合成成本均较低。研究者通过对KSL进行抑菌试验及哺乳动物细胞毒性检测,证实KSL具有强抑菌活性及低溶血副作用。当存在表面活性剂或生物被膜受机械破坏时,应用KSL可对成熟生物膜的生存产生明显的抑制作用。

    KSL及其类似物(KSL-W)仅由10个氨基酸残基构成,分子量小,免疫原性低;对大部分兼性厌氧菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)为62.5~125 μg/ml,对白假丝酵母菌的最小抑菌浓度与最强抗真菌剂两性霉素B相同,仅为0.2 μg/ml,小于蛙皮素Ⅱ的1/7。由此可见,KSL在口腔局部的应用有良好的前景。

    1.抗菌口香糖:

    Na等实验结果表明,口香糖中添加的KSL在咀嚼20 min后能释放出80%,并能有效抑制唾液中变异链球菌的活性。然而,KSL在唾液环境中的稳定性不佳,肽键Lys6-Val7及Phe5-Lys6在唾液中易断裂,通过Trp替换Lys6氨基酸残基得到类似物KSL-W稳定性更佳,在口香糖中较KSL能更稳定的释放,具有更好的抑菌效果。

    2.抗口腔白假丝酵母菌感染:

    白假丝酵母菌广泛存在于自然界,也存在于正常人口腔内,一般在正常机体中数量少,为条件致病性真菌。当人体免疫系统异常时,可引起口腔黏膜感染,导致鹅口疮、口角炎等黏膜疾病。Hong等研究发现,KSL-W能有效抑制白假丝酵母菌的黏附、生长及其向菌丝转化,阻止白假丝酵母菌生物膜的形成。同时,其还可通过阻断白假丝酵母菌对上皮细胞的刺激作用,降低其对组织细胞的毒性作用。

    3.抗种植体周围炎:

    Simonis等对种植体10~16年成功率的回顾性调查研究表明,无牙周病史的个体因种植体周围炎导致种植失败的概率达10.53%,而因牙周病缺失牙行种植修复的个体,其种植体周围炎发生率高达37.93%。这表明存在于牙周组织的病原体可通过牙周袋转移到种植体周围,增加种植体周围炎发生的可能。Li等通过实验证实KSL及KSL-W对种植体周围炎的主要致病菌如牙龈卟啉单胞菌、梭核杆菌等有很好的抑制效果,但对真核细胞无明显的细胞毒性。

    四、展望

    众所周知,继发龋是牙体缺损充填体修复失败的主要原因之一,研究表明树脂充填修复后有50%的充填体产生继发龋。尽管随着科技与材料学的发展,各种新型修复材料已经应用到牙体缺损的修复中,但仍不能完全避免继发龋的产生。继发龋的发生,不仅影响龋病治疗的成功率,也不利于剩余牙体组织的保存。变异链球菌是口腔龋病的主要致病菌之一,Lobo等研究证实,在自酸蚀粘接系统中加入抗菌物质,可以降低牙体充填后继发龋的发生率。因此,开发能抑制继发龋发生和发展过程的口腔材料是一个重要的研究方向。

    目前,已有大量抗菌剂应用于口腔材料的相关研究。Melo等在粘接处理剂中加入纳米银离子、季铵盐和不定形磷酸钙,能有效杀灭牙体窝洞中残留的细菌,并能抑制细菌沿充填体边缘的侵入。Syafiuddin等在树脂材料中添加一种富含银和锌的磷灰石粉末使树脂具备抗菌能力,但同时也导致了树脂材料色泽不稳定及机械性能降低。Jedrychowski等尝试在树脂中添加洗必泰等有机抗菌剂,也明显导致树脂强度降低。壳聚糖是由几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的,具有优良抑菌活性。Elsaka通过实验证实,含0.12%壳聚糖的粘接剂可抑制变异链球菌的生长,且不影响树脂粘接的强度。但对于壳聚糖是否会引起口腔内菌群紊乱尚缺乏进一步证据。

    KSL及其类似物作为小分子抗菌肽,具有抗菌谱广、抗原性低、生物毒性小等优点,据此推测在树脂酸蚀粘接系统中加入抗菌肽KSL或其类似物,充填后的树脂充填体能长期释放出达到或超过最小抑菌浓度的抗菌肽,从而抑制变异链球菌的生长,减少充填后继发龋的发生。许多研究表明,人工合成抗菌肽KSL及KSL-W对高龋患者口腔内变异链球菌有良好的抑菌效果。

    目前,尚无进一步关于KSL或KSL-W混入树脂粘接剂或树脂复合体中是否能发挥抗菌效果减少继发龋以及对树脂粘接材料强度影响的研究。研究KSL及其类似物混入树脂粘接剂或树脂复合体中对继发龋生化过程影响,有利于改善目前树脂充填修复因继发龋失败的现状。

编辑: 陆美凤

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