复合树脂类牙科材料细胞毒性研究

2017-7-14 15:07  来源:中国实用口腔科杂志
作者:陈秀春 张志民 张雅琪 洪丽华 郑鹏 李文月 阅读量:774

    口腔修复材料的体外细胞毒性试验(cytotoxicity test)是常用的检测材料生物安全性的方法之一,即采用体外组织细胞培养方法而进行的牙科材料生物学评价筛选试验,观察材料对细胞生长繁殖及形态的影响,评价其体外细胞毒性。Geurtsen等研究表明,牙科树脂材料可以向水或有机溶质中释放30多种不同物质,包括大量的单体、添料成分、聚合系统复合物(引发剂、稳定剂、阻聚剂等),并研究了其中部分成分对不同细胞毒性的影响。

    复合树脂固化过程中部分基质固化不全导致单体残留,残留单体主要有双酚A 双甲基丙烯酸缩水甘油酯(bisphenol A digly-cidylmethacrylate,Bis-GMA)、双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯(triethylene glycoldimethacrylate,TEGD⁃MA)、氨基甲酸酯双甲基丙烯酸酯(Urethane di⁃methacrylate,UDMA)和甲基丙烯酸2-羟乙酯(2-hydroxyethyl methacrylate,HEMA)等。这些单体分子是造成树脂材料在临床应用过程中产生聚合收缩、微渗漏等多种缺陷的主要原因,同时这些单体的释放会对多种真核细胞造成毒性,如影响细胞增殖,干扰细胞氧化还原系统造成氧化应激,从而引起细胞周期停滞在特定阶段,影响白细胞向炎症部位聚集,干扰正常的细胞炎症反应应答等,进而导致某些临床患者出现充填后敏感及疼痛等并发症。

    树脂类材料长期存在于口腔中,物理磨损和化学反应以及口腔环境中存在的多种维持细胞正常功能的酶,会引起树脂成分的降解,其降解产物也是造成细胞毒性的部分原因。Bis-GMA仍是临床应用树脂材料的主要基质成分,该成分可通过氧化反应、水解作用和酯化反应等,产生诸如甲醛、甲基丙烯酸等可引起细胞毒性的物质。TEGDMA是常用的稀释剂成分,可被降解为2,3-EMA(2,3-epoxymethacrylic acid)和E-BPA(ethoxylated bisphenol A),会对细胞产生毒性作用。近年来,为达到更高效、安全、无副反应的治疗方式,新型树脂材料不断推出,针对这些材料的生物安全性检测也越来越广泛,其细胞毒性和作用机制的研究方法不断深入。

    1.用于毒性检测的细胞

    1.1 动物细胞系及原代细胞

    根据ISO10993-59(2009)行业标准,推荐细胞为性状稳定的细胞系,如L929小鼠成纤维细胞,同时在能证明实验的可重复性和精准性的前提下,依据对检测的敏感性不同也可选择其他细胞系,如NIH3T3 细胞、P53 缺陷的V79 细胞等均被广泛用于树脂材料细胞毒性测试。Becher 等用小鼠原代肺泡巨噬细胞和J744A1巨噬细胞系研究树脂中HEMA 与TEGDMA 引起的细胞死亡的模式表明,HEMA诱导的细胞死亡主要是以凋亡的形式发生。但细胞系细胞存在着接触抑制丧失、核型异常等缺陷,不能很好地代表体内正常细胞的反应,因而大量相关研究采用了人源细胞来进行细胞毒性检测。

    1.2 人口腔原代细胞

    牙科树脂类修复材料长期存在于口腔环境中,采用人口腔原代细胞检测其毒性能更好地反映材料细胞毒性的真实情况。比较常用的用于检测细胞毒性的口腔原代细胞包括牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligamentfibroblast,HPLF)、牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)和牙髓成纤维细胞(human pulp fibroblast,HPF)等,其他细胞如与重建牙科学相关的未分化牙髓细胞OD-21也被用于检测含生物玻璃填料的新型复合树脂的细胞毒性,因该细胞具有填补受损牙髓细胞的多分化潜能,如对该细胞产生毒性作用可能会直接影响受损组织的修复功能。Geurtsen等研究了不同细胞对树脂材料浸出成分的敏感性,结果表明,HPLF细胞和HPF细胞敏感性要高于3T3和HGF细胞,而细胞对材料的敏感性直接影响实验结果,敏感性越高的细胞越能精准地反映材料毒性。不过人原代细胞的提取存在来源有限、批次间差异大等缺陷。

    有研究者用小鼠成纤维细胞L929与人胚胎干细胞来源成纤维细胞EBf-H9和原代培养人牙髓细胞hDPCs共同检测氢氧化钙和复合树脂材料的细胞毒性发现,对于氢氧化钙和复合树脂的毒性反应,L929细胞与hDPCs有较大差异,EBf-H9比L929细胞更接近hDPCs的反应。EBf-H9为胚胎干细胞,在合适条件下可以无限增殖,且核型正常,批次间差异小,具有替代永生化细胞系用于牙科材料生物安全性检测的可能性。

    2.用于检测毒性的实验方法

    2.1 细胞水平的毒性检测

    2.1.1 针对细胞膜通透性改变的毒性测试

    较为常见的是琼脂膜覆盖法,通过半定量方法观察细胞溶解区和脱色区范围来直接评价材料对细胞膜的破坏程度。Sahin等用琼脂膜覆盖法证明了不同固化方式及聚合温度对树脂成分的义齿基托材料弯曲强度及细胞毒性的影响,表明提高聚合温度和时间可以减少残余单体量,减小细胞毒性。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)是稳定存在于活细胞中的胞质酶,其渗出增加提示细胞膜稳定性破坏,因此LDH释放法被用于细胞毒性的检测。Cataldi等用LDH测定实验证实,唾液并不能降低复合树脂对于变形链球菌共同培养的HGF细胞产生的毒性作用,并证实了添加纳米银复合材料的生物安全性。

    2.1.2 以细胞的代谢活性作为评价指标

    利用活细胞内的线粒体脱氢酶可将检测试剂盒中的相应试剂还原,生成结晶物,而结晶物的产量与细胞数量及其活性呈正相关,通过比色测定吸光度值,其大小即可反映存活细胞数量的多少及细胞活性的强弱,从而反映出细胞毒性的大小。常用的检测方法为MTT法、XTT法、WST-1法及CCK8法。目前应用较多的是CCK8法,其优点是检测过程简便,结果精确,可重复性好。Walters等采取刃天青染色、WST-8以及MTS实验检测HGF 的增殖率,结果显示48 h 内刃天青染色与WST-8实验结果相似,而72 h后刃天青染色值明显大于WST-8 组,MTS 实验则显示细胞增殖较低。近年来,Alamar Blue细胞存活力测试因其无毒无害且不影响抗体分泌及合成等优势而被用于细胞毒性检测。

    2.2 分子生物学检测

    近年针对树脂细胞毒性的研究逐渐深入到基因蛋白等分子水平,评价方法从整体动物和细胞水平深入到了分子水平。彗星试验和微核试验是常用的细胞基因毒性检测方法,两者联合使用,可起到互补作用。流式细胞术近年也被广泛应用于树脂基成分,如TDGEMA、HEMA引起的细胞凋亡的检测。Teti等采用实时定量PCR、Western Blotting和免疫荧光技术证实,HEMA可同时干扰α1Ⅰ型原骨胶原的合成及其RNA的表达,表明HEMA分子对正常细胞活性的影响。Moharamzadeh等通过ELISA实验表明,BisGMA、TEGDMA 和UDMA 并不能刺激HGF和Hala细胞的炎症因子IL-1β的释放。

    3.与细胞毒性密切相关的分子及毒性机制

    3.1 HEMA

    HEMA是树脂粘接剂成分中的主要分子,含量为30% ~ 35%,分子量轻,且具有亲水性,容易穿透牙本质渗入到成牙本质细胞中,从而影响细胞存活力。尽管有研究表明HEMA渗出物的含量低于树脂成分的其他单体,但HEMA在较低浓度时就可引起细胞毒性已被学者证实。HEMA 产生毒性的原因与氧化应激相关,HEMA会诱导细胞内ROS的产量增加,而GSH的清除增加了氧化应激产生的程度。氧化应激会进一步导致与凋亡相关的半胱天冬酶-8、-9和-3的活化,并活化促丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)细胞外信号调节激酶(ERK)、P38MAPK等,从而引起细胞凋亡的发生。核因子(nuclear factor,NF)-κB是细胞生长分化的诱导剂,在HEMA引起的成纤维细胞、牙髓基质细胞和淋巴细胞的凋亡中可被活化,抑制细胞凋亡的发生。

    Grande等研究表明,HEMA可导致与变形链球菌(S. mutans)共培养的HGF细胞的Ⅰ型胶原的合成减少,S. mutans 本身的黏附和存活力也降低,推测与NF-κB的活化相关。Ginzkey等通过彗星实验和微核实验研究表明,即使在明显低于已报道引起细胞毒性浓度以下,1 mmol 的HEMA 就可引起淋巴细胞的DNA迁移明显增加,从而表现出基因毒性。

    3.2 TEGDMA

    TEGDMA 是复合树脂基质常用的稀释剂成分,同时也是大多常用牙本质粘接剂的组成成分,含量为25%~50%,稀释体系的同时参与体系的聚合,其亲脂性能使其容易进入哺乳动物细胞质和膜磷脂中。研究表明,TEGDMA可清除HGF细胞内的抗氧化剂还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH),从而造成细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的增加,继而导致酶失活、脂质过氧化、DNA 变性断裂及细胞凋亡的发生。Batarseh 等的研究进一步表明,TEGDFA可同时诱导细胞内和细胞外凋亡通路的活化。Nganga等证实,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)可与TEGDMA直接接触形成复合物,从而抑制其因氧化应激而导致的细胞毒性发生。另有研究表明,TEGDMA通过下调cdc2基因、cdc25基因和细胞周期蛋白B1的表达,并上调P21基因的表达而造成舒张血管作用,从而引起细胞坏死。TEGDMA同样具有基因毒性作用。Huang 等研究发现,TEGDMA 可造成鼠巨噬细胞系RAW246.7的DNA断裂,DNA凝聚等DNA 损伤,继而导致细胞死亡,且证明TEGDMA引起的细胞死亡呈浓度依赖性,并且凋亡和坏死同时发生。

    3.3 Bis-GMA

    Bis-GMA 为树脂基质的主要成分,占整个基质体系的70% ~ 75%,因其较高的含量而被认为是引起复合树脂细胞毒性的主要原因。研究表明,Bis-GMA可以刺激细胞外信号,调节激酶磷酸化作用,调节TNF-α和前列腺素PGE2产量、COX-2mRNA和蛋白质表达以及ROS产量,Bis-GMA会潜在影响牙髓组织活力或引起牙髓炎症,也会干扰牙髓成纤维细胞的正常分化。Yano等研究表明,Bis-GMA 可减少G1期、S期和G2/M期的牙髓细胞数量,增加sub-G1期细胞数量,提示有因其基因毒性而引起的细胞凋亡的发生,但当将暴露在低浓度Bis-GMA下细胞中的Bis-GMA移除后,可见细胞活力仍可恢复。另有研究表明,血红素氧合酶1在牙髓细胞中表达,是牙髓细胞的一种保护机制,可避免因Bis-GMA引起的氧化应激损伤。

    近年来,伴随着应用于后牙的大块树脂、添加生物玻璃填料的新型树脂以及抗菌性树脂等新型复合树脂材料的诞生,有关复合树脂材料生物相容性的研究也逐渐从细胞水平深入到分子水平,尽管确切的调控机制及更安全无毒的替代物尚未研制成功,但为后续研究取得更具临床应用价值的牙科复合树脂材料奠定了基础。

编辑: 陆美凤

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