临床上，由牙周病、外伤、肿瘤以及骨质疏松症等系统性疾病导致的牙颌面缺损发病率较高，可造成不同程度的牙列缺损/缺失、剩余牙槽嵴低平、牙槽骨缺损、种植体周围骨缺损，甚至大面积颌骨以及软组织缺损，伴发全身性疾病时会使病情加重，治疗和修复较困难，严重危害患者的身心健康，患者进行牙颌面软硬组织缺损修复的迫切需求日益增大。
近年来，基于自体干细胞的组织工程技术发展迅速，因其取材不涉及伦理争议，无免疫原性，无需等待供体进而可避免治疗时机的延迟，且可避免乙肝、艾滋病等传染性疾病的传播，已成为国内外研究的热点，获取活性和功能良好的自体种子干细胞是研究的关键所在。
干细胞的特性主要表现在两个方面，自我更新和多向分化能力，在人的成体干细胞中，间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）是目前组织修复中最常使用的种子细胞，已被证明具有直接成骨分化的潜力，免疫排斥较低，同时可通过调整释放的营养因子促进组织再生，目前人体骨髓、脂肪、皮肤、牙齿等多个部位的间充质干细胞已被成功分离。其中，人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）是一类存在于人牙髓组织（乳牙、恒牙）中具有较强的自我更新和多向分化潜能的间充质干细胞，由Gronthos首次发现和命名。
牙髓干细胞取材方便、易扩增保存、活性高，较人体其他间充质干细胞更具优势，在合适的体内或体外环境下可分化为多种人体细胞，为组织、器官修复和自体、异体移植等细胞治疗提供细胞来源，被认为是用于组织工程和再生医学最易获取和最有前景的多功能间充质干细胞。大量关于牙髓间充质干细胞应用于组织再生修复或免疫调节治疗的研究，均显示出其良好的应用前景，现就牙髓间充质干细胞的生物学特性研究及其应用进展综述如下。
1.牙髓间充质干细胞的生物学特性
1.1分离培养与鉴定
牙髓间充质干细胞的分离培养主要有两种方法，联合酶消化法（DPSCED）和外植体法（DPSC-OG）。研究人员一般从临床拔除的智齿、正畸减数牙、脱落乳牙、无治疗价值的牙周炎患牙、多生牙以及牙髓炎患牙拔除的牙髓组织中获取人牙髓间充质干细胞。联合酶消化法因更加便捷、高效而应用相对广泛，其步骤为牙齿拔出后，使用氯化钠冲洗表面并立即放入预冷的含双抗（100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素）的α-MEM培养基中，无菌条件下取出牙髓，切除根尖部约2mm的牙髓组织，使用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，剪成大小约1mm×1mm×1mm的组织块，浸于3mg/mL的I型胶原酶和4mg/mL的中性蛋白酶（体积比1∶1）消化液中37℃消化1h，将形成的单细胞悬液通过孔径为70μm的细胞筛网，离心后将细胞沉淀用含20%胎牛血清+100U/mL青霉素+100mg/mL链霉素的α-MEM培养液重悬，以1×104-1×105cells/mL密度接种于培养瓶，常规培养、扩增。
Lizier使用外植体法，将同一块乳牙牙髓组织每3-4天机械法转移至新的培养皿，可持续原代培养至少6个月，结果显示早期原代培养产生的牙髓干细胞和晚期原代培养产生的牙髓干细胞的细胞形态和干细胞表面标记表达未发生改变。研究显示，不同的分离培养方法可影响牙髓间充质干细胞的增殖和多向分化潜能，进而导致无法完全重复实验结果或对其物学特性描述结论不同。使用基质细胞表面抗原1（STRO-1）染色和/或流式分析仪对细胞进行鉴定，牙髓间充质干细胞阳性表达CD73、CD90、CD105等间充质干细胞特异性表面标志物，不表达CD34、CD45、CD14、CD19和HLA-DR等标记物，提示细胞有良好的增殖分化能力。
Takazumi研究显示，牙髓组织中因含有结缔组织、间充质细胞、神经纤维、血管和淋巴管，认为从牙髓组织中直接分离贴壁培养的牙髓间充质干细胞/前体细胞或包含两种类型的细胞，可再生细胞和非再生细胞，使用流式细胞荧光分选技术进一步分选纯化，低表达低亲和力神经生长因子（LNGFRLow+）和高表达胸腺细胞抗原1（THY-1High+）两种细胞表面标记的牙髓间充质干细胞具有更好的增殖和成骨能力。
1.2多向分化潜能
牙髓间充质干细胞起源于胚胎发育过程中的神经嵴，具有多向分化潜能，在不同的微环境下，可表现出特定的分化特征，且通过改变微环境的条件，可增强或抑制其分化能力。牙髓间充质干细胞可向成骨细胞、神经样细胞、脂肪细胞、皮肤细胞、肝肾细胞等分化，被广泛应用于组织再生医学或免疫调节治疗的研究。因此，有学者指出，牙髓组织或是整形外科、口腔及口腔颌面外科组织重建、器官修复的重要干细胞来源；牙髓间充质干细胞将成为临床疾病治疗的重要干细胞，拔除的第三磨牙、正畸减数牙、多生牙等将不再被视作医疗废弃物。
1.3传代与衰老
研究显示，代数越年轻的干细胞活性越好，多次传代可诱发细胞衰老，经20-40代倍增后，间充质干细胞（MSCs）会丧失一些生物学特性/效能。因此，牙髓间充质干细胞在使用中会面临同样的问题，且牙髓组织本身量较少，可分离培养的细胞数量较少，因此拟获得足够的细胞应用于临床需进行多次传代，但多次体外传代会降低细胞的效力，体外扩增合适的代数以使细胞活性和数量均能满足体内应用仍需进一步研究。牙髓间充质干细胞在临床治疗方面累积的资料还较为有限。
据在利用MSCs治疗移植物抗宿主病（GVHD）时发现，新鲜组织中MSCs的数量（骨髓或脂肪组织）对于治疗量是不足的，部分探索MSCs间接体内疗法的临床试验显示，扩增代数最少者，患者应答和反应更好，进而生存更好。这与Choi等结果一致，比较了骨髓来源的MSCs在3、5、7、9代治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）的效果，显示较早代数的MSCs最适合治疗，因与较晚代数的MSCs相比，较早代数的MSCs细胞更稳定、抗炎特性更好、神经保护特性更强。因此，较早代数的牙髓间充质干细胞更适合用于组织修复或疾病治疗，一般多选用2-5代牙髓间充质干细胞用于实验研究。
1.4与供体年龄的关系
不同年龄、来源的干细胞的生物学活性存在差异，对干细胞基因组、端粒、细胞周期抑制因子、线粒体等相关的分子机制的研究表明，干细胞亦存在增龄性功能下降，表现为干细胞数量的减少和分化方向的改变。牙髓间充质干细胞的活性与供体年龄的关系尚存争议，目前研究较多的是乳牙、19-29岁患者拔除的正畸减数牙和智齿来源的牙髓间充质干细胞。
有研究表明，牙齿的年龄不同，所分离的牙髓间充质干细胞展现的沿特定细胞系分化的特点和倾向或不同。与恒牙牙髓间充质干细胞相比，乳牙牙髓间充质干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）增殖速率更快，更利于细胞使用前的体外扩增；取材过程简单、无痛。但部分学者比较了年轻恒牙牙髓间充质干细胞和SHEDs，提示不同来源、不同年龄的牙齿来源干细胞（DSCs）在细胞形态、增殖速度、细胞表面标志物的表达、分化潜能方面表现相似，因此，恒牙牙髓间充质干细胞和SHEDs这两种细胞，从临床应用的角度来说，应是同等的机会。
已有大量使用年轻恒牙牙髓间充质干细胞与SHEDs进行对比的体内移植实验研究，但结果均显示二者的效果相似；甚至有研究显示，恒牙牙髓间充质干细胞的体外可传代次数更多，而其成骨能力等生物学特性不受影响。Laino研究了45岁人的牙髓间充质干细胞，其生物学性能仍良好；Wu比较了儿童、青少年、成年及老年人牙髓间充质干细胞的生物学特性，结果显示老年人牙髓间充质干细胞分化能力相对减弱；Yi体外比较了12-25岁与60-70岁人牙髓间充质干细胞的生物学特性，发现年龄相关的衰老影响牙髓间充质干细胞的体外增殖和分化能力。
本课题组首次成功分离培养高龄老年人（≥80岁）牙髓间充质干细胞，最大供体年龄达94岁，体外培养的高龄老年人牙髓间充质干细胞高表达人间充质干细胞表面标记物CD73（99.90%）、CD90（99.97%）、CD105（99.86%），不表达造血干细胞和内皮细胞标记CD14、CD19、CD34、CD45及HLA-DR（0.66%），具有一定的增殖和分化潜能。因此，下一步明确随着年龄的增长，牙髓干细胞如何受自身或身体环境的影响；发现细胞衰老状态的生物标记，建立可靠的测量年龄诱导效应的方法，确定牙髓间充质干细胞老化的分子基础；了解牙髓间充质干细胞衰老与机体衰老之间的关系，以及如何利用基因工程等手段改善或逆转衰老对其生物学特性的影响具有重要意义，保持牙髓间充质干细胞的活力、延缓其衰老、延长其寿命无疑将进一步优化牙髓间充质干细胞未来在临床中的应用。
2.与人体其他间充质干细胞的生物学特性对比
2.1与其他牙源性干细胞相比
牙源性干细胞有很多种，现已成功分离并鉴定出牙髓间充质干细胞、牙周膜干细胞、根尖牙乳头干细胞、牙龈间充质干细胞、牙囊干细胞等。与牙周膜干细胞等其他牙源性干细胞相比，健康牙齿的牙髓组织因被封闭在牙髓腔内，牙髓间充质干细胞可能更不易被细菌、化学、机械刺激等外界环境所影响，易于从脱落或拔除的乳恒牙中分离培养和扩增，是自体干细胞的理想来源，但部分研究显示牙周膜干细胞的矿化和成骨能力更强。
2.2与非牙源性间充质干细胞相比
与骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞等间充质干细胞相比，牙髓干细胞取材更方便、易于扩增保存、活性高、免疫原性和致瘤性低，更利于临床应用。这与牙髓间充质干细胞的胚胎发育起源与上述间充质干细胞等的起源不同有关，牙髓间充质干细胞源自神经嵴细胞，胚层起源的差异，使得牙髓间充质干细胞的表型与骨髓间充质干细胞等间充质干细胞不同。
本课题组关于颌骨来源骨髓间充干细胞与四肢骨来源的骨髓间充质干细胞对比研究亦验证了这一点，研究首次阐述了胚层起源不同在两种骨髓间充质干细胞衰老状态等生物学特性变化中的作用，发现人BMSCs的增殖和成骨分化能力会随年龄的增加而显著下降，成脂分化能力增强，但其活性及受年龄影响的程度存在差异：老年人颌骨来源的BMSCs，胚胎发育过程中来自外胚层神经嵴，其增殖和成骨分化特性优于中胚层间充质起源的四肢骨BMSCs，并首次利用中老年人颌骨骨髓间充质干细胞成功对兔的下颌骨临界骨缺损进行了修复，初步验证了其在组织工程修复中的有效性。
3.牙髓间充质干细胞的临床应用研究
3.1用于牙齿及颌骨组织的再生修复
牙髓间充质干细胞是用于牙齿和骨组织工程的理想干细胞，现已有第三磨牙、尖牙和乳牙来源的牙髓间充质干细胞应用于牙本质、牙周组织、牙髓组织、颌骨缺损修复等体内外研究的报道，均显示出良好的再生能力。
一是牙周和骨组织缺损的再生修复研究，使用支架材料复合牙髓间充质干细胞、生长因子等，以使局部牙槽骨高度得以改善；“人牙髓间充质干细胞注射液”新药注册申请获国家食品药品监督管理总局受理，未来可用于治疗慢性牙周炎所致牙周软硬组织缺损。
二是牙髓神经的再生修复，Kuang制备载牙髓间充质干细胞的纳米微球，低氧预处理后，注射植入原位牙髓修复大鼠模型，生成牙髓样组织；Huang使用聚乙交酯-丙交酯多孔支架材料，接种牙髓间充质干细胞，牙髓间充质干细胞向成牙本质细胞分化，并形成牙本质样结构和牙髓样组织；Xuan开展的一项随机对照临床试验，招募40例年轻恒牙外伤后牙髓坏死患儿，随机分至自体乳牙牙髓间充质干细胞髓腔植入实验组和行根尖诱导成形术对照组，结果显示，与对照组相比，实验组再生出含血管和感觉神经的三维牙髓组织，牙根长度显著增加、根尖孔显著减小（P＜0.0001），治疗后随访24个月，未观察到任何不良事件，提示hDPSCs或能够再生整个牙髓，为年轻恒牙外伤后牙髓坏死的治疗提供了新的思路，但尚需大样本、多中心的进一步临床试验研究。随着该技术的快速发展，目前通过充填牙胶以封闭根管腔为目的的根管治疗有望被以充填牙髓间充质干细胞复合生物活性材料实现全牙髓再生修复的治疗方法所替代。
三是“生物牙根”的重建，Gao等使用生物支架材料、异体牙髓间充质干细胞、牙周膜干细胞等的动物实验显示，可重建出结构和功能类似于天然牙根的“生物牙根”。
3.2用于口腔以外组织的再生修复
因牙髓间充质干细胞为神经嵴起源，除应用于牙齿、骨组织再生，其在肌肉、神经、皮肤再生等领域的利用潜能独具优势，因此或可用于口腔以外的组织，例如肌肉、骨骼系统的修复。已有牙髓间充质干细胞用于糖尿病所致严重肢体缺血，组织、骨坏死所缺损、烧伤所致皮肤损伤的再生以及肝脏、神经、骨骼肌肉、血管及皮肤再生，显示出良好的应用前景。
3.3用于免疫调节治疗
牙髓间充质干细胞具有较强的免疫调节作用，能通过诱导免疫耐受，降低炎症反应导致的组织损伤，有利于损伤组织的恢复和预后改善，现已被应用于多种免疫系统疾病的免疫调节治疗，例如系统性红斑狼疮、结肠炎、多发性硬化症等，受试对象在接受干细胞或其分泌物治疗后，相关症状得以缓解，2型糖尿病、类风湿性关节炎也有望通过牙髓间充质干细胞进行治疗。研究发现，干细胞治疗的免疫调节机制更宏观和多元化，干细胞进入血液循环后会较快发生凋亡，但这种凋亡正是其治疗机制的一部分，凋亡过程中的干细胞与机体免疫系统相互作用，引发系列链状反应，细胞活性越好，与机体相互作用越强。因此，活性良好的牙髓间充质干细胞在上述疾病的治疗中可发挥更大的作用。
4.展望
牙髓间充质干细胞具有良好的自我更新与多向分化潜能，取材方便安全、易扩增和保存，将来应用于组织再生修复和临床治疗，但目前在临床治疗方面累积的资料仍较为有限，应用也多处于I期临床试验阶段；在植入宿主体内后的生物学作用和发挥作用的机制与调控，以及向其他组织分化方向的研究尚处于起步或基础研究阶段；临床可使用的牙髓干细胞有无供体年龄上限，确定牙髓干细胞老化的分子基础，建立可靠的测量年龄诱导效应的方法等等，国内外均尚未见深入研究报道，因此对其来源和生物学特性的全面研究仍是该领域探索的热点。综上，随着材料学、分子生物学、组织工程技术的进一步发展以及对牙髓间充质干细胞生物学性能的进一步深入了解，必将推动牙髓间充质干细胞的临床应用，并最终有望成为一项成熟的临床技术。
