壳聚糖促进牙釉质仿生矿化修复的研究进展

    牙釉质是全身唯一无细胞性、由上皮细胞分泌继而矿化的组织，在损伤以后几乎无法自我修复。牙釉质覆盖于牙冠表面，是龋病最先侵及的组织。牙釉质龋最早的临床表现是白垩斑（white spot lesion，WSL），由酸蚀脱矿形成多孔状病变体部和脱矿解离的钙、磷离子在牙釉质表面重新沉积形成的表层组成。
    釉质龋的形成主要是因为再矿化－脱矿平衡被打破。若能够抑制脱矿，促进再矿化，那么WSL在早期阶段是可逆的。再矿化治疗是采用人工方法使脱矿、软化的釉质再矿化，恢复硬度，终止或消除早期龋损。其中，仿生矿化模拟了牙釉质在体内的自然形成过程，是有机基质介导的定向成核和生长羟基磷灰石（hydroxylapatite，HAP）晶体的过程，成为目前具有前景的牙釉质修复方法。
    仿生矿化材料可促进脱矿牙釉质表面实现定向有序的再矿化，而且力学性能接近于正常牙釉质水平，是治疗早期龋的新途径。壳聚糖（chitosan，CS）是一种天然的阳离子多糖，是甲壳素N－脱乙酰基的产物，而甲壳素是地球上仅次于纤维素的第二大普遍存在的聚合物。壳聚糖具有优异的化学和生物性能，已广泛运用于牙釉质和牙本质的仿生矿化领域。本文就壳聚糖促进牙釉质仿生矿化原理及其应用的研究进展作一综述。
    1.壳聚糖的性能
    壳聚糖的化学结构与细胞外基质的主要成分糖胺聚糖相似，而且牙釉质的形成发生在细胞外基质中，所以壳聚糖具有优异的生物相容性。壳聚糖主链上氨基可结合质子，壳聚糖分子链在溶液中以聚电解质的形式存在，与带负电的阴离子或聚阴离子发生相互作用形成复合物，相互作用力常见为静电作用。因此，壳聚糖还具有防酸、储存和输送钙磷离子、抗菌和粘结等性能。
    1.1抑制脱矿
    壳聚糖具有抑制牙釉质脱矿的作用。致龋菌代谢产酸致使pH降低，酸性溶液中带正电荷的H+与牙釉质中带负电荷的磷酸盐结合，将导致矿物质流失。牙釉质表面的壳聚糖的氨基可从酸中捕获这些H+，形成保护层，防止H+扩散到牙釉质矿物表面。Arnaud等研究表明壳聚糖可干扰牙釉质脱矿过程，抑制磷的释放。在其浓度为2.5～5.0mg/mL，作用时间为60～90s时，维氏显微硬度较高，对矿物质流失的最大抑制率为81%。
    1.2储存和输送钙磷离子
    根据HAP溶解平衡方程式，过饱和的钙磷离子有利于抑制HAP晶体的溶解和促进再矿化。壳聚糖是钙和磷酸盐离子的“储存库”。壳聚糖的高含氮量使其成为一种潜在的载体，可以携带钙和磷酸盐等离子进行仿生矿化。
    更重要的是，壳聚糖具有穿透牙釉质的能力，能够向病变深层输送再矿化离子。其原理是2.5g/mL的壳聚糖醋酸溶液的pH值为3.30，能够酸蚀龋损表面，打开晶体之间的缝隙，而且壳聚糖分子足够小，可以通过静电作用穿透牙釉质并结合到脱矿晶体上。Zhang等研究表明壳聚糖的穿透性与其浓度呈正相关。当壳聚糖浓度为2.5g/mL时，可穿透至釉牙本质界。即使存在人工唾液薄膜，壳聚糖促进龋损下再矿化的能力也并未受到影响。
    1.3抗菌
    抗菌与再矿化的结合更适用于临床上的牙釉质修复。壳聚糖是天然的抗菌剂。带正电荷的壳聚糖可与带负电荷的细菌细胞壁成分（如脂质、磷脂、碳水化合物和蛋白质等）相互作用，影响细菌的代谢，改变细胞壁的通透性，螯合一些细菌生长必需的金属元素，减少牙菌斑生物膜的形成，防止细菌的进一步定植。
    壳聚糖是聚电解质，其抗菌性与pH值相关，pH值降低，氨基所带的正电荷增强，抗菌活性亦随之增强。壳聚糖对链球菌和乳杆菌等致龋菌具有抗菌活性。Ren等研究发现壳聚糖－釉原蛋白衍生肽水凝胶对变形链球菌生物膜的生长、乳酸产量和代谢活性均有较长时间的持续抑制作用。
    此外，Pakravanan等研制的壳聚糖－无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate，ACP）纳米粒子含漱液对变形链球菌、血链球菌和口腔链球菌具有抗菌性能，且优于市面上的OralB和氯己定含漱液。
    1.4粘结
    在临床上，牙面和修复材料的牢固粘结是一个亟待解决的问题。材料粘结不良可导致牙釉质修复界面出现缝隙，可能出现微渗漏导致继发龋。壳聚糖主链上的氨基在酸性溶液中（pH＜6.5）结合质子，使其大分子在酸性介质中带正电荷，能够粘结在带负电荷的牙釉质表面。这种静电相互作用与壳聚糖主链刚度、相关离子基团的性质以及溶剂中离子强度有关。
    Ruan等研究发现壳聚糖－釉原蛋白水凝胶（chitosan-amelogenin hydrogel，CS-Amel）中新形成的晶体直接生长在原始牙釉质上，实现了修复层与天然牙釉质的完全粘合，界面致密，可以潜在地提高修复体的耐久性，并避免在修复体边缘形成继发龋。
    2.壳聚糖复合材料在牙釉质修复中的应用
    仿生矿化技术不是简单地将壳聚糖与无机矿物混合构建复合材料，而是模拟生物矿化过程：以壳聚糖为载体，采用有机分子（釉原蛋白、仿生多肽或者壳聚糖衍生物等）作为模板，有效调节无机物的成核、晶体生长、相变、颗粒组装过程，从而构建与牙釉质结构和功能接近的复合材料。
    2.1壳聚糖水凝胶
    在溶液体系中钙磷离子扩散速率很快，蛋白和多肽或许不能有效调节磷酸钙晶体的生长以及最后形貌的控制。水凝胶是壳聚糖牙釉质仿生矿化中常应用的形式，其可通过物理或者化学交联凝胶化的方法制备。相比溶液系统，凝胶状环境的物理化学性质更贴近分泌期和形成期的釉基质。而且，水凝胶在临床上更容易操作，在牙面上有效浓度的滞留时间相对较长。
    2.1.1壳聚糖－釉原蛋白/仿生多肽水凝胶
    釉原蛋白在牙釉质发育中的晶体的成核以及晶体的生长方向和速度调控上发挥重要作用。壳聚糖具有良好的生物相容性，而且在修复层的合成过程中，壳聚糖分子不会影响釉原蛋白的功能。CS-Amel水凝胶可稳定预成核的Ca-P团簇，将其排列成线状链，最终转变成牙釉质状磷灰石晶体。
    Ruan等研究表明CS-Amel水凝胶可在牙釉质表面形成一层厚约15μm的牙釉质样结构层，并且该矿物层与牙面紧密结合、晶体垂直于牙釉质表面c轴方向，呈束状有序排列，类似于天然牙釉质结构。然而，修复层的弹性模量和硬度仍达不到天然健康牙釉质的水平，而且水凝胶干燥和矿化完成需要7d的时间。水凝胶复合材料形成的晶体间残留有蛋白和凝胶，导致修复层机械性能不佳，可通过蛋白水解酶去除有机物来改善。
    Prajapati等研究发现在CSAmel水凝胶中加入基质金属蛋白酶-20（matrix metalloproteinase-20，MMP-20）可防止新形成的晶体内蛋白质阻塞。与未加MMP-20的CS-Amel水凝胶相比，经MMP-20-CS-Amel水凝胶处理后的样品的新生长晶体具有更均匀的取向和更高的结晶度，显著提高了修复牙釉质的弹性模量和硬度（分别为1.8倍和2.4倍）。
    水凝胶载体的稳定性是临床应用的必要前提。增加壳聚糖浓度可提高水凝胶的黏度，提高载体的稳定性。Ruan等研究了黏度对合成晶体大小和取向的影响，结果表明在CS-Amel水凝胶中形成有序牙釉质晶体的最佳条件是质量浓度为20g/L的壳聚糖。
    天然釉原蛋白提取成本较高，且容易受pH值等环境的影响。部分学者转而进行含有相同功能的蛋白质类似物的制备。Ren等在5个Gln-Pro-X重复序列（QPYQPVQPHQPMQPQ）中增加亲水性片段（TKREEVD）组成釉原蛋白衍生肽，并命名为QP5，CS-QP5水凝胶能长期促进早期牙釉质龋的再矿化。Ding等研究表明氟化物与QP5联合应用对牙釉质龋再矿化有潜在的协同作用，修复层的显微硬度明显提高。
    仿生多肽比釉原蛋白具有更好的前景，因为仿生多肽更易于穿透釉柱间隙，使再矿化过程更有效；而且更重要的是，其可人工合成，纯度更高，保质期更长，避免了人体来源的蛋白可能存在的诸多问题。
    2.1.2磷酸化壳聚糖－胶原水凝胶
    磷酸化壳聚糖（phosphorylated chitosan，Pchi）可模拟磷酸化蛋白在生物矿化中的作用。Pchi和明胶交联成阳离子－阴离子复合物，可巧妙地键合晶体中残余磷酸根，形成明胶网状框架以定向诱导晶体成核和生长。姚静等将磷酸化壳聚糖－胶原水凝胶接枝到牙釉质表面，生成了致密、成片排列的新生晶体层，结合强度大大高于再矿化形成的晶体，然而在力学性能上还是存在一定的缺陷。
    任迅等在实践中发现新生矿物晶体的硬度虽与正常牙釉质有一定的差距，但已显著超过牙本质，随着在口腔中时间的延长，硬度会不断增加，越来越接近正常牙釉质，但是这一过程较为缓慢，常需要数月至数年时间。
    2.2壳聚糖纳米复合物
    仿生矿化体系还包含通过颗粒附着的非经典结晶途径，经过亚稳态的无定形相相变为结晶相的非经典结晶过程。生物体通过合成无定形矿物，可以实现更加高效的物质运输，从而提升矿化的效率。ACP是牙釉质生长最初形成的矿物，但是其并不稳定。
    在牙釉质仿生矿化中，非晶态纳米前体的稳定化非常关键，三乙胺和酪蛋白磷酸肽等有机大分子被应用于稳定ACP纳米颗粒，但是其存在稳定离子过饱和度的能力较低或不适用于牛奶过敏的人群等缺点。部分学者对具有优异生物相容性且可稳定ACP的Pchi和羧甲基壳聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）进行探究。
    2.2.1Pchi-ACP纳米复合物
    Pchi的磷酸基团对Ca2+具有螯合能力，固定的Pchi分子可结合Ca2+形成成核位点，而游离的Pchi分子可抑制溶液中磷酸钙沉淀的形成，所以Pchi可用于稳定ACP，形成Pchi-ACP纳米复合物。虽然ACP对牙釉质的亲和力极低，微观结构上难以匹配和识别，但是磷酸化蛋白是可以很容易地吸附在HAP晶体的表面。因此，Pchi-ACP纳米复合物可提供稳定的ACP吸附在牙釉质表面以促进再矿化。
    Zhang等研究表明Pchi-ACP纳米复合物既可修复原始牙釉质中釉柱的缺损，也能够使得ACP转变为HAP，在原位形成致密的修复层。其处理牙釉质再矿化速率比氟化物快，而且修复层表面矿物颗粒较少，表面较为光滑。但是其再矿化的过程较长，需要3个月时间。
    2.2.2CMC-ACP纳米复合物
    CMC富含功能性羧甲基，可以使ACP颗粒内的钙离子不受带负电荷的磷酸根离子的影响，是ACP的良好稳定剂。但是，在CMC作用下，ACP相变为HAP的效率低、耗时长，常需要NaClO折断CMC的β-（1，4）糖苷键，释放ACP的活性以实现快速再矿化。
    Xiao等研究表明在模拟釉原蛋白的嵌合肽的作用下，经NaClO修饰的CMC-ACP纳米复合物可以排列成阵列，再矿化7d后可形成与天然牙釉质力学性能相近的类牙釉质晶体，并与脱矿牙釉质特异性结合，实现了快速仿生再矿化。CMC-ACP形成的纳米颗粒比较松散，而加入溶菌酶（lysozyme，LYZ）可形成边界清楚的CMC/LYZ-ACP纳米凝胶，更好地应用于临床。
    此外，离子强度的变化能够调节溶液中分子间和分子内的静电作用，所以加入NaCl是控制CMC/LYZ-ACP纳米凝胶解离的更为简单策略。Song等研究表明通过NaCl调节离子强度以解离CMC/LYZ-ACP纳米凝胶，脱矿牙釉质表面可形成一层无棱柱状的牙釉质样结构层。无棱柱状的修复层矿化程度高，比鱼鳞状牙釉质表面更坚硬，渗透性更低，可起到屏障作用，有利于早期牙釉质龋的预防和治疗。
    2.3壳聚糖－磷酸钙微凝胶
    牙釉质不仅是承载新形成纳米结构的基质，而且脱矿牙釉质微晶前区的活性中心可作为再矿化的活性成核位点。壳聚糖微凝胶可作为磷酸钙沉积的有机模板。实现原位形成ACP到结晶度较低的非化学计量比的HAP。Simeonov等研究表明壳聚糖－磷酸钙复合微凝胶（chitosan-calcium phosphates microgels，CS-CaPMGs）每天作用于脱矿牙釉质6h，重复7次，可有效促进磷酸钙在脱矿牙釉质表面成核和生长。
    当总的再矿化过程42h结束时，整个脱矿牙釉质病变区域被牙釉质样组织覆盖，纳米晶体约50nm，但结晶度较低。重要的是，其过程中形成HAP的主要前体—磷酸八钙和磷酸二氢钙，这是天然HAP形成过程所特有的阶段。由此可见，CS-CaPMGs的仿生矿化过程更接近天然的牙釉质生物矿化。
    而且，Simeonov等发现CS-CaPMGs再矿化存在一个诱导期：在最初的18h内，ACP溶解并沉积钙磷离子在脱矿牙釉质表面以促进成核和晶体的形成，之后磷酸钙才开始第2阶段的生长，在牙釉质表面形成鱼鳞状的微晶。此外，CS-CaPMGs再矿化过程模拟了口腔环境在夜间无饮食摄入的持续再矿化时间段，更加贴近于临床应用。
    3.小结
    综上所述，壳聚糖及其衍生物作为再矿化剂具有良好的再矿化、抗菌和粘结性能；壳聚糖复合材料实现了具有良好力学性能的牙釉质样结构的仿生矿化，但修复层的结构与天然牙釉质还有一些差距。目前，ACP向HAP的有序结晶缺乏足够的认知，还需进一步地探究。
为满足临床应用的条件，还需要进一步探究壳聚糖制备、结晶时长的影响因素，且壳聚糖复合材料工艺流程的优化有待继续探索和研究。此外，目前研究多局限于体外实验阶段，未来还需要开展基于口腔内复杂的生物环境（温度、pH、口腔细菌以及液体的量和成分等）的体内研究。