三维石墨烯及其衍生物在牙源性干细胞成骨中的研究进展

    石墨烯是由英国曼彻斯特大学物理学家Andre和Konstantin于2004年发现的以碳原子sp2 杂化而形成的具有蜂巢状平面结构的多环芳烃原子晶体，其结构稳定，具有高电导率、低密度、高比表面积和良好的机械强度等特点，在许多领域都有较好的应用前景。
    石墨烯的衍生物主要包括氧化石墨烯（graphene oxide，GO）和还原氧化石墨烯等。氧化石墨烯具有良好的亲水性，对生物分子有出色的亲和力，而还原氧化石墨烯既有亲水基团又有疏水基团，同时具有一定的电传导性和生物分子亲和力。
    近几年研制出的三维（three-dimensional，3D）石墨烯，与同样具有三维结构的石墨不同，3D石墨烯由石墨烯片组装而成，具有大量大孔结构，而石墨是由石墨烯片层层堆积而成，不具有丰富的孔隙结构。
    3D石墨烯及其衍生物相比于2D石墨烯具有更立体的空间结构和更丰富的嵌合位点，细胞在其上呈现出聚集性生长，而在2D石墨烯上则散在随机分布，这是因为3D石墨烯上细胞形态改变，相互接触增加，产生了更丰富的生物学行为。
    3D石墨烯可以通过自组装、模块介导、3D打印等方法制备，继而应用到各领域。此外，石墨烯在口腔医学领域的潜在应用非常广泛，如成骨、递药、抗菌、粘接、美白等。本文主要对近年来3D石墨烯及其衍生物对牙源性干细胞的成骨作用进行总结，为进一步研究石墨烯的成骨应用提供参考。
    1. 3D石墨烯及其衍生物的形态特点及生物相容性
    3D石墨烯及其衍生物根据制备方法不同可形成水凝胶、泡沫、海绵等形态。其中，水凝胶状石墨烯可通过自组装技术将石墨烯纳米粒子混杂在三维水凝胶网络中制得。水凝胶具有灵活性好、含水量大、生物相容性好、机械性差等特点，而石墨烯纳米粒子具有良好导电性和机械强度，二者相互协同，可以增强材料性能。
    此外，石墨烯具有递药和促成骨等功能，与水凝胶易降解的特点结合，可将石墨烯水凝胶用于药物控释及治疗骨缺损等领域。泡沫状石墨烯可由化学气相沉积法（chemical vapor deposition，CVD）或水热法等方式制成。
    CVD是将气态石墨烯粒子沉积到金属模板上，再将金属模板蚀刻去除从而得到泡沫状石墨烯壳的方法。水热法是在高温高压条件下进行的化学反应，是一种制备高稳定性石墨烯泡沫的简便方法。泡沫状石墨烯具有质量轻、柔韧性好、电阻值小、骨传导性好和生物相容性良好的特点，其大孔结构和高表面积有利于细胞的粘附生长和营养物质运输。海绵状石墨烯可由氧化石墨烯胶体真空离心蒸发去除胶体中的溶剂制得。
    海绵状石墨烯与泡沫状石墨烯在结构特点上较为相似。此外，还可利用3D打印技术直接形成3D石墨烯支架，或将石墨烯纳米粒子涂覆到一些具有三维多孔结构的支架表面，如聚乳酸支架、钛支架等，从而增强支架的机械强度和生物学效应。
    3D石墨烯及其衍生物的生物相容性主要取决于其形状、尺寸、浓度等。边缘形态通过影响石墨烯材料对细胞膜的穿透力从而影响细胞毒性。实验表明具有锋利边缘形态的石墨烯更有可能破坏细胞膜，从而导致细胞死亡。由于细胞倾向于粘附在较大的材料表面生长，较小尺寸的材料易被细胞吞噬或吞噬失败，从而增加材料毒性。
    实验表明亚微米尺寸[（390.2±51.4）nm]和纳米尺寸[（65.5±16.3）nm]的石墨烯能诱导细胞自噬从而引发细胞凋亡，而微米尺寸[（1089.9±135.3）nm]生物相容性相对较好。不同浓度的石墨烯会导致细胞产生不同程度的反应，体外实验发现高浓度（超过100μg/mL）的氧化石墨烯能引起氧化应激反应，而低浓度的氧化石墨烯对淋巴细胞无毒性作用；含有1μg/mL氧化石墨烯的3D胶原蛋白支架对成骨细胞MC3T3-E1的毒性和未处理的胶原蛋白支架大致相当。
    体内实验发现将含有0.3%氧化石墨烯的光固化复合树脂填料用于修复大鼠实验性下颌骨缺损，未发现明显排斥反应和全身器官毒性。另外，Wang等将3种含不同比例石墨烯（0.25wt%、0.50wt%、0.75wt%）的3D聚己内酯/石墨烯支架植入大鼠颅骨缺损模型中，经大体观察、组织切片和免疫相关因子分析发现所有支架均有良好的生物相容性。
    2. 3D石墨烯及其衍生物在牙源性干细胞中的成骨作用
    牙源性干细胞是一种具有细胞分裂和自我更新能力的间充质干细胞，具有多向分化的能力。牙源性干细胞可来自牙髓、牙周膜、根尖乳头、牙囊等处，包括牙髓干细胞（dentalpulp stem cells，DPSCs）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、牙囊干细胞（dental follicle progenitor cells，DFPCs）和脱落乳牙牙髓干细胞（stem cell populations from human exfoliated deciduous teeth，SHED）等，其中DPSCs、PDLSCs、SHED均发现有关石墨烯成骨的研究，而DFPCs尚未见相关报道。
    2.1 在DPSCs中的成骨作用
    DPSCs来源于牙髓，具有分化为成骨细胞、成牙本质细胞、脂肪样细胞和神经样细胞等多种细胞的潜能，自体DPSCs可从正畸拔除牙或拔除的智齿等获得。由于3D石墨烯可以促进BMSCs成骨，又有研究发现，DPSCs和骨髓基质干细胞（bone marrow stemcells，BMSCs）的cDNA序列有超过4000种基因序列具有相似的表达程度，其中PDGF、TGF-1、BMP-2等基因与矿化骨基质的形成有关。所以学者们将目光聚焦于3D石墨烯能否诱导DPSCs定向分化为成骨细胞，使其达到成骨目的。
    采用CVD法形成的单层石墨烯培养DPSCs 28d可观察到矿化基质的形成，成骨相关基因的表达上调而成牙本质相关基因的表达下调，由此推断生成的矿化基质是由DPSCs成骨分化而来，证明石墨烯可诱导DPSCs成骨向分化。DPSCs还可在含有氧化石墨烯涂层的胶原膜上增殖，并表达出高水平的PGE-2、BMP-2、RUNX-2等成骨相关基因，说明石墨烯衍生物能诱导DPSCs分化为成骨细胞。
    3D支架的空间结构相比于平面结构能为细胞提供更多粘附界面，增强细胞的生物学行为，从而促进DPSCs向成骨分化。多孔钛表面细胞的粘附面积比普通钛板增加了近3倍，DPSCs在氧化石墨烯包被的多孔钛表面的增殖速度加快，培养14d后检测到ALP、OCN等成骨标志物含量显著增多，说明材料的多层多孔结构促进了DPSCs的成骨向分化。
    类比GO加入壳聚糖中促进干细胞成骨分化，以含聚N-异丙基丙烯酰胺共聚物/氧化石墨烯复合物的壳聚糖可注射温敏水凝胶培养DPSCs发现，细胞形态正常，无细胞壁破裂，且随GO 含量的增加细胞的附着和生长增加。材料中还检测到矿物沉积和碱性磷酸酶活性，排除壳聚糖的影响后发现，GO能在早期促进RUNX-2基因高表达，在晚期促进OCN基因高表达，证明该水凝胶为DPSCs提供了仿生胞外基质微环境，促进DPSCs增殖并向成骨分化产生矿化基质。
    此外，有团队采用溶胶-凝胶法和胶体法合成了三维介孔生物活性玻璃（MBN）/氧化石墨烯（GO）复合材料，研究其促DPSCs细胞分化和矿化性能。GO与MBN合成可以改善其生物相容性，且GO能增强MBN机械强度。结果显示，DPSCs在该复合材料上的分化水平比在单纯MBN上生长时有所增高，且ALP、BMP-2和RUNX-2的表达也大幅增多，再次说明向材料中加入GO可以促进DPSCs分化和矿物沉积。以上多项实验结果均证明，3D石墨烯及其衍生物可以有效促进牙髓干细胞成骨向分化，并产生矿化基质。
    2.2 在PDLSCs中的成骨作用
    牙周膜干细胞是牙周组织发育完成后存留于牙周膜中未分化的间充质干细胞，可分化为成骨细胞、神经样细胞、脂肪样细胞等。
    由于丝素蛋白（Silk Fibroin，SF）被广泛用于制作组织工程中的三维支架，有实验组在涂覆有GO 的丝素蛋白膜（GO-SF）上培养牙周膜干细胞发现，细胞的增殖分化明显比在单纯丝素蛋白膜上旺盛，说明GO的加入可以促进牙周膜干细胞生长。学者还探究了多种GO-SF衍生材料培养牙周膜干细胞的效果，发现加入还原氧化石墨烯的支架能促进更多成骨相关因子的表达。
    有课题组将GO包裹在氢氧化钠处理后的钛板（GO-Ti）上培养牙周膜干细胞。通过扫描电镜可观察到钠钛板表面呈疏松多孔的结构，而GO呈片状覆盖在其表面。GO包裹的钠钛板相比于未被包裹的钠钛板（Na-Ti）上可以观察到牙周膜干细胞的形态较早发生变化，细胞间建立了较多的细胞连接，且细胞内表达较多的F-肌动蛋白，证明细胞更适于在GO-Ti上生长。培养7d后，GO-Ti上出现较高的ALP 活性和较明显的COL-1、RUNX-2等成骨相关因子的表达，说明石墨烯衍生物可以促进牙周膜干细胞成骨向分化。
    对比石墨烯的二维和三维结构对牙周膜干细胞成骨的影响发现，使用CVD法在铜箔上蚀刻制备的2D石墨烯薄膜和CVD法借助镍泡沫支架制备的3D石墨烯泡沫分别培养PDLSCs，3D石墨烯较大的表面积和空间结构为牙周膜干细胞提供了生成、维持和修复组织的环境，其上培养的细胞具有高附着、增殖快、寿命长等特点，且成骨相关基因和蛋白的表达比2D石墨烯更高，3D结构中的细胞可能对激素的反应更好，对生长因子的要求较低。该实验还发现生长在3D石墨烯泡沫上的PDLSCs，与细胞骨架蛋白合成有关的MHY10、MHY10-V2基因表达提高，提示石墨烯的三维物理结构能够促进细胞的形态改变。
    还有研究制备了氧化石墨烯胶原海绵，将其用于修复狗的牙周Ⅱ类根分叉缺损，术后4周的组织切片和CT显示，缺损周围有牙周韧带样、牙骨质样组织和牙槽骨形成，证实3D氧化石墨烯可恢复牙周附着。
    2.3 在SHED中的成骨作用
    SHED来源于脱落的乳牙牙髓，具有成牙本质细胞向分化、骨诱导、免疫调节等功能，它比DPSCs更容易获得，对个体损伤较小。虽然均为牙髓来源的干细胞，但由于SHED与DPSCs的发育情况不同，两者的成骨作用有一定差别。马来西亚的学者定性和定量比较了DPSCs与SHED的增殖和成骨作用，发现在观察的所有时间点SHED的细胞密度均比DPSCs高，并且自培养的第9天起，SHED培养基中测得的ALP活性开始高于DPSCs，说明SHED的增殖和成骨分化能力更强。
    由于量子点可用于与介孔材料合成多孔的复合材料用于生物医学领域，现有研究石墨烯量子点诱导SHED成骨分化。有团队利用GO和氧化石墨烯量子位点（graphene oxide quantum dots，GOQD）培养SHED以观察其促成骨分化能力，发现1μg/mL的GO和GOQDs最有利于细胞增长繁殖，同时可观察到GOQDs可以均匀分布到细胞质内以调控其分化。检测成骨相关基因的表达可发现，相同时间内GOQDs组的OCN、COL-1、RUNX-2、β-连环素的表达都比GO组高，说明GOQDs促进SHED成骨分化的能力比GO强。
    3.小结与展望
    3D石墨烯及其衍生物作为一种新兴材料在各领域均有良好的应用前景。其良好的生物相容性及能诱导细胞成骨分化的能力，使其能在骨组织工程中发挥重要的作用。随着对该材料在诱导牙源性干细胞成骨方面的研究，未来可设计出更多具有良好性能的石墨烯衍生物，以满足口腔临床的各种特殊需求。