代谢组学在口腔鳞状细胞癌早期诊断及精准诊疗中的研究进展

    早期诊断、早期治疗是提高口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）患者5年生存率的关键。尽管OSCC部位表浅，但由于早期症状不明显，易延误诊治，据报道约2/3患者诊断时已属中晚期。
    目前，针对OSCC早期诊断标志物研究主要集中于基因组学、蛋白质组学和转录组学等方面，虽然取得了一定的研究进展，但仍缺乏检测高效、快速、特异性强的生物标志物或差异物。光学成像技术、组织自发荧光、高频超声等临床辅助诊断手段对早期OSCC口腔病变的筛查能力仍较弱。
    组织病理学检查作为明确诊断和选择治疗方案的重要方法，但属于有创诊断且耗时长，并受取材部位及病理医师经验等诸多因素影响。因此，建立快速、准确的术前诊断、术中（安全切缘）及术后监测方法，提高OSCC诊断（筛查）的准确性，制定精准治疗方案和预后评估方法，达到精准施治的目标已成为OSCC治疗的热点。
    代谢重编程是肿瘤的重要特征之一，即肿瘤细胞通过改变代谢通路来调节或适应组织微环境的改变，并为自身的快速生长提供能量。甚至其邻近的“正常”细胞，其代谢也已发生了改变，且不同类型及状态的细胞会呈现其独特的代谢谱，即特定的“代谢指纹”，因此，代谢物也是放大了的基因和蛋白质变化，通过分析代谢差异物可早期发现变异的组织或细胞。
    与基因组学、转录组学和蛋白质组学等研究将要或如何发生的变化相比，代谢组学（metabolomics）研究位于基因和蛋白质的下游，是研究已经发生的变化，具有定义表型的优势。
    OSCC患者与健康人群以及口腔癌前病变（precancerous lesions，PLs）患者组织、血液及唾液内存在明显的差异代谢物，表明代谢物变化可辅助OSCC的早期筛查。另外，患者的肿瘤与邻近组织和细胞处于不同病变阶段、对治疗敏感性不一、预后不同的患者都存在代谢物方面的差异，表明通过观察代谢物的变化也可甄别病变组织和细胞，以实现OSCC的精准诊疗。
    1. OSCC与代谢重编程
    肿瘤快速无序增殖导致肿瘤微环境内营养物质缺乏，肿瘤细胞则通过改变其代谢程序以满足其自身增殖、侵袭等需要。与正常细胞相比，肿瘤的生物能量代谢已发生显著改变。代谢组学研究对象为分子量1000Da以内的糖、有机酸、脂质、芳香烃和氨基酸等化合物。通过对代谢物进行定性、定量分析，发现并筛选差异代谢物，确立OSCC的代谢谱，探索其调控机制。目前，主要从糖、脂质及氨基酸代谢等方面来探讨OSCC异常代谢特征。
    1.1 OSCC与糖代谢异常
    实体肿瘤普遍依赖糖酵解代谢提高利用葡萄糖提供能量并合成中间产物，且肿瘤中糖代谢相关的基因谱已被证实发生了改变，因此异常的糖代谢已被作为肿瘤的诊断和预后的重要特征之一。糖酵解相关酶如己糖激酶2、丙酮酸激酶M2和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）在OSCC中上调，同时葡萄糖转运蛋白（glucose transporters，GLUT）高表达，提示OSCC中发生着活跃的糖酵解。
    丙酮酸是糖酵解途径的最终产物，OSCC患者血清中丙酮酸水平远高于健康人群。过量的丙酮酸在乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的作用下可转变为乳酸，而LDH 不但在OSCC组织中表达显著升高，其在血液和唾液中的表达也显著升高，唾液中LDH 水平（164U/L）对于口腔癌前病变区分的准确性达100%，敏感性达88%；而唾液中LDH 水平（8U/L）对于口腔癌的区分准确性可达83%，敏感性达88%，可以辅助OSCC早期诊断。
    而且研究表明，肿瘤微环境中的间质细胞，例如肿瘤相关的成纤维细胞（CAF）的糖代谢也发生异常。不但乳酸在OSCC细胞中的积累将表现出增强的致癌性，肿瘤微环境中CAF糖酵解产生的乳酸也同样会促进OSCC细胞的迁移和侵袭。由此可见，糖酵解代谢产物乳酸和丙酮酸的水平可作为OSCC诊断指标。
    1.2 OSCC与脂质代谢异常
    脂质是脂肪与类脂的总称，各种功能不同的脂质构建了灵活而庞大的代谢网络，以满足细胞生物学需求。在包括OSCC等肿瘤内，不仅脂质的摄取和储存增加，而且脂质合成也异常活跃，代谢过程中产生了各种代谢中间产物，如甘油磷酰胆碱、油酸酰胺、甘油二酯、鞘脂等，不但活化了OSCC细胞膜结构或转化信号，且维持了肿瘤干细胞特性，促进了OSCC的进展。
    研究发现OSCC患者血清胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白水平随着肿瘤的发生和发展逐渐降低，提示这3种脂质的变化也可辅助判定OSCC 的进展。参与OSCC 患者脂质代谢的136个代谢酶在基因水平发生异常表达，其中36个与预后相关，11个与临床病理特征相关，调控脂质代谢相关的基因TGFB1、SPP1及SERPINE1也可有效辅助判定OSCC。
    1.3 OSCC与氨基酸代谢异常
    氨基酸不但参与维持细胞氧化还原平衡提供能量，还可通过影响表观遗传以调控细胞命运，是肿瘤异常代谢的重要组成部分。肿瘤中存在“嗜谷氨酰胺”现象，即肿瘤细胞为了满足自身对谷氨酰胺的需求，其不但通过自身合成，还必须通过谷氨酰胺转运体（alanine-serine-cysteine transporter，ASCT2）摄取外源性谷氨酰胺。
    在OSCC患者中发现谷氨酰胺对肿瘤细胞的增殖至关重要，且高表达ASCT2的OSCC患者预后较差，体外实验发现抑制ASCT2功能可显著抑制OSCC细胞的增殖。OSCC内也存在高精氨酸水平，是OSCC的独立预后因素，因此剥夺患者体内的精氨酸水平是治疗OSCC的潜在策略。其次，谷氨酰胺作为天冬酰胺的氮供应源，其高表达不但促进了天冬酰胺的合成，且天冬酰胺合成酶基因ASNS在OSCC中表达较高，并与淋巴结转移及OSCC的神经侵犯呈正相关。
    2.检测差异代谢物在OSCC临床诊疗中的作用
    正常人群、癌前病变与OSCC代谢物存在差异已被确认。检测差异代谢物及其变化可以初步筛查OSCC和癌前病变；分析不同肿瘤发展阶段（淋巴结转移、远处转移及复发等）内差异代谢物种类，以辅助确定疾病的恶性程度并制定精准诊疗方案。近年通过将质谱技术及人工智能结合，许多特征性差异代谢物被发现并证实，为高效快速寻找OSCC特异差异物奠定了基础。
    2.1 在OSCC及癌前病变的筛查中的应用
    唾液作为一种生理性液体，具有获取简便且无创优势，是开展无创诊断的理想材料。而口腔白斑作为最常见的癌前病变，报道有1.58%~27.27%发生恶变，探究其与OSCC之间的差异代谢物以早期鉴别OSCC与口腔白斑显得尤为重要。通过对34例健康人、32例口腔白斑患者及37例OSCC患者的唾液进行了代谢组学分析，发现了5个代谢物（c-氨基丁酸、苯丙氨酸、缬氨酸、n-二十烷酸和乳酸）均可有效区分口腔癌及健康人；进一步用人工智能的分析方法发现缬氨酸、乳酸和苯丙氨酸区分OSCC和健康人的阳性预测率为86.5%；区分口腔癌和白斑的阳性预测率为87.5%。
    Sridharan等利用代谢组学比较了OSCC与白斑患者唾液内的差异代谢物，发现1-甲基组氨酸、肌醇1，3，4-三磷酸、d-甘油酸-2-磷酸、4-硝基喹啉-1-氧化物、2-氧代精氨酸等在OSCC及白斑患者中显著改变，提示这些差异代谢物具有诊断价值，但是其临床应用还需要继续进行大样本及多中心的验证。
    Ishikawa等对OSCC、口腔黏膜上皮异常增生及疑似癌前病变患者的唾液进行代谢组学分析，发现6个代谢物在OSCC与可疑口腔黏膜病变中明显不同，进一步分析发现鸟氨酸、邻羟基苯甲酸酯和5-磷酸核糖这3种代谢物可有效区分疑似癌前病变患者与OSCC及口腔黏膜上皮异常增生患者。
    Wei等通过代谢组学对我国OSCC患者（125例）、癌前病变患者（124例）及健康人（124例）进行了大样本代谢组学分析，结果发现30种代谢物在OSCC及癌前病变患者中显著变化，进一步利用机器学习的方法建立了一个模型，其诊断口腔癌的准确性达86.7%。
    与唾液相比，血清更能实时反映机体的生理或病理状况，微创即可获取，因此也是代谢组学分析诊断OSCC等口腔疾病的理想液体。健康人、癌前病变患者及OSCC患者血清中的代谢物存在显著性差异，且代谢组学研究发现4种代谢物（谷氨酰胺、丙酸盐、丙酮和胆碱）可区分健康人及OSCC患者，准确率达93.5%；谷氨酰胺、丙酮、醋酸盐和胆碱这4种代谢物可有效区分OSCC及癌前病变患者，准确率达92.4%。
    对OSCC组织、癌前病变组织及正常组织进行代谢组学分析，发现31种代谢物可有效区分这OSCC及癌前病变，准确性达90.2%。研究表明唾液、血清中大部分异常改变的代谢物源于肿瘤组织，差异代谢物的对照检测可对OSCC筛查起到较好的指导作用。
    2.2 在OSCC精准诊疗中的应用
    快速冷冻病理检查为术中评估切缘状态提供了可靠保障，而原位质谱技术的应用为评估OSCC手术切缘状态及安全距离提供新的辅助手段。OSCC及其邻近组织中代谢物改变已被确认，包括乳酸、天冬氨酸、天冬酰胺等的上调，葡萄糖、丙氨酸、丙酮酸等的下调。
    Yang等对32个配对的OSCC肿瘤和不同距离黏膜切缘组织样本进行代谢组学分析，非靶向代谢组学分析发现10个氨基酸（包括赖氨酸、脯氨酸、丙氨酸等）和9个氨基酸（丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸等）作为阴性切缘和非典型性异常增生切缘候选代谢标志物；进一步进行靶向代谢组学分析发现4个氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸等）可作为阴性切缘标志物，6个氨基酸（天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸等）作为异常增生切缘标志物。异常增生切缘标志物天冬氨酸、天冬酰胺具有一定的临床指导意义，其代谢关键酶天冬酰胺合成酶（ASNS）与OSCC患者的不良预后相关，可能参与OSCC 的发生发展。
    Yang等原位质谱成像技术在脂质组学水平精准确定OSCC黏膜安全切缘距离，并在冰冻切片上原位确定口腔鳞癌阳性切缘、阴性切缘的脂质分子标志物首次对成功构建出由14个递减的癌性脂质分子组成的诊断模型，该诊断模型的离子质谱成像能够可视化区分肿瘤组织和不同距离黏膜切缘组织，并可直接在冰冻切片上清晰勾勒黏膜切缘安全距离、预测不同切缘状态。
    同时，研究初步确定9个脂质分子作为OSCC阴性切缘标志物，1个脂质分子作为阳性切缘标志物，这些研究成果将来或许可以通过手术切缘代谢物检测实时判断手术边缘的“安全缘”，以消除那些形态学上“正常”，实质上已“恶变”的细胞或组织。
    利用代谢物变化也可辅助判定患者的临床分期。研究发现血清中与糖酵解有关的代谢物（丙酮酸和乳酸）被认为与OSCC患者临床分期或病理分期有关。OSCC 患者血清中TC、HDL 和LDL水平随着肿瘤的进展逐渐降低。OSCC患者手术前后14种血清变化的代谢物，其中琥珀酸和次黄嘌呤与肿瘤分期、无复发生存率有关。这些研究表明，在OSCC 进展的不同阶段代谢物间具有差异，代谢物表达水平的变化可用于判断肿瘤分期。
    OSCC代谢物的变化还可用于预测疗效，以协助选择有效的治疗手段。Ye等验证了与糖酵解、氧化还原平衡和合成代谢进展有关的代谢物预测化疗疗效的准确性可达81.25%~100%。Zuo等发现OSCC患者术前和术后的血清中的代谢物存在差异，且存在低浓度琥珀酸和次黄嘌呤的患者不易复发。
    Tsai等筛选出可以确定OSCC患者是否有淋巴结外转移的差异性代谢物，例如天冬氨酸、丁酸等。Fu等发现L-精氨酸水平与OSCC患者的神经侵犯相关，而相应的精氨酸合成酶可通过调控精氨酸代谢促进OSCC的转移及神经侵犯。随着代谢组学及人工智能的快速发展，更多种类的代谢物被发现及更准确的预测模型的建立必将推动OSCC精准诊疗水平。
    3.展望
    代谢组学是离表型最近的检测技术，利用其识别差异的代谢物，特别是与其他学科的工具（如人工智能、机器学习）相结合，快速筛选OSCC差异代谢物可辅助临床医生有效地对OSCC开展早期筛查和精准诊疗。而空间代谢组学的提出，为评估OSCC深部安全切缘及安全距离提供全新的视角。
    当然，代谢组学检测差异代谢物仍存在一定的局限性，如成本高、无法普及和准确性尚待提高，报道的研究样本量较小，定性分析较多等。因此，亟待（1）开发相关差异代谢分子组合谱（Panel），提高诊断的准确性；（2）扩大临床试验的规模，开展多中心研究，为临床转化应用奠定基础；（3）医工交叉，应用人工智能等技术，获得更加精准的诊断预测模型；（4）结合蛋白质（酶）及转录和基因组学研究，探寻差异代谢物的根源和机制。