适配体的应用及其在口腔领域的研究进展

    近年来，有关适配体在生物医学领域的研究迅速发展。适配体是一种通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）在DNA或RNA文库中筛选得到单链DNA或RNA，能够与小分子、蛋白质和细胞等靶标特异性结合。
    疾病的早期诊断与治疗是治愈疾病的关键，然而某些疾病可能表现出非特异性症状，导致假阴性延误治疗时机，增加治疗失败的风险。此外，个性化的精准治疗对疾病治疗至关重要。由于具有高特异性、低免疫原性和低成本等特点，适配体已在药物递送、疾病的诊断和治疗等方面有了广泛的应用。本文将就适配体的特点和其在口腔医学中的应用作一综述。
    1.适配体的发展和特点
    1.1适配体的发现与筛选
    自20世纪80年代Cech等发现RNA具有催化作用以来，研究者们对核酸识别并作用于特定位点的功能探索也随之兴起。1990年，Tuerk在研究T4噬菌体DNA聚合酶（gp43）与编码mRNA间的相互作用时发现，gp43在与该mRNA5'端一个8个核苷酸的发夹结构及Shine-Dalgarno序列结合时，可以抑制该mRNA转录的开始以进行自我调节。
    为探究这一相互作用，Tuerk开发了SELEX技术，即通过构建一个随机的RNA文库，利用硝酸纤维素膜筛选出与gp43有亲和力的RNA序列，对其进行扩增并进行下一轮筛选，如此往复，最终获得2个能特异性结合gp43的RNA序列。同年，Ellington等通过类似方法，开发出能与对应靶标特异性结合的核酸片段，并将这种片段命名为“aptamer（适配体）”。适配体在与靶标结合时，会形成茎、环、发夹、突起、假结和G-四链体等结构，通过氢键、范德华力、碱基堆积力、静电作用和疏水相互作用等与靶标形成一个稳定的复合物结构。
    随着技术进步，SELEX技术也不断得到革新和发展。在构建核酸文库时，有学者采用非天然核苷酸替代传统的核苷酸。在筛选方式上，毛细管电泳SELEX技术（capillary electrophoresis-SELEX，CESELEX）、微流控芯片SELEX技术（chip-based microfluidic SELEX，M-SELEX）等改良技术提升了筛选的效率。
    在结合对象上，免疫沉淀偶联的SELEX技术（immunoprecipitation-coupled SELEX，IP-SELEX）被用以筛选与蛋白高特异性结合的适配体，而细胞SELEX技术（cell-SELEX）是将整个细胞作为结合的靶点进行筛选。
    1.2适配体的特点
    1.2.1合成加工简单，重复性好
    适配体通过SELEX的方法在体外获得，不依赖细胞、动物等。生产成本较低、合成周期短，且结构简单，不同生产批次间的差异小，适合大规模生产。适配体还可以进行不同的修饰，如荧光标记、药物结合等，以适应不同的需要。
    1.2.2亲和力高、特异性强、靶标范围广
    适配体的亲和力高，通过反向筛选，还可以减少甚至消除非特异性结合。适配体靶点范围广，包括小分子（如无机离子和小分子药物等）、大分子（多肽和蛋白质等）、细胞或组织，可应用于重金属检测、农药检测、食品检测、疾病诊断与治疗等。
    1.2.3免疫原性低
    适配体在体内免疫原性低，目前认为免疫系统不能直接识别适配体，适配体也没有多余的Fc段，避免了与Fc受体结合导致的副作用。
    1.2.4稳定、保质期长
    适配体具有热稳定性，对温度变化不敏感，更易存储和运输。
    2.适配体在口腔领域的研究进展
    随着对适配体认识的不断深入，越来越多的功能化适配体正在被开发出来。近年来，口腔医学领域关于适配体的研究也正在兴起。
    2.1疾病诊断
    2.1.1口腔疾病的诊断
    变异链球菌是重要的致龋菌，由于各型变异链球菌之间具有同源性，可将变异链球菌视为“变异链球菌组”，进一步将其分为仓鼠链球菌（S.cricetus）、鼠链球菌（S.rattus）、变异链球菌（S.mutans）、表兄链球菌（S.sobrinus）等，其中变异链球菌和表兄链球菌与龋病密切相关。研究各型链球菌之间的差异和联系，对致龋菌的研究和龋病预防诊断具有重要意义。
    Cui等通过SELEX技术筛选出适配体H19，可从低致龋性变异链球菌菌株中识别高致龋性菌株，为龋病的早期诊断提供了一种可能方案。牙周炎病变呈静止期和活动期交替出现，并且有部位特异性，因此对牙周炎活动性快速、精确和客观地判断在临床诊疗中具有重要意义。当前牙周炎唾液检测标记物主要有微生物来源、宿主来源标记物，后者又分为反映牙周组织炎症和反映牙周组织破坏的标记物。
    牙周炎龈沟液中的牙源性成釉细胞相关蛋白（odontogenic ameloblast-associated protein，ODAM）是牙周炎的代表性标志物之一，连接牙齿表面与结合上皮，因附着丧失导致ODAM被释放到龈沟液当中。Lee等筛选出针对ODAM不同结合位点的一对特异性适配体OD64和OD35，并基于这对适配体开发出了夹心型侧流生物传感器，其能够在缓冲液和唾液标本中定量检测ODAM蛋白，为牙周炎的诊断提供了新的思路。
    2.1.2与口腔相关全身疾病的诊断
    近年来，唾液与全身疾病的关系越来越得到重视，随着唾液组学的发展，唾液检测全身疾病技术日趋成熟。糖尿病与牙龈炎、牙周炎、龋齿及某些真菌感染的口腔疾病密切相关。Malathi等发现2型糖尿病患者的唾液淀粉酶水平较健康人群显著升高。人β-防御素（humanβ-defensins，HBD）水平与感染性、免疫性疾病和全身压力等相关，是一种反映口腔免疫状态、具有特异性的重要标记物。
    García-Berrocoso等的研究表明HBD可作为诊断中风后早期神经病变的潜在标志物。Minagawa等先后合成了能够特异性识别唾液α-淀粉酶（salivary α-amylase，sAA）和HBD的适配体，可在唾液中检测sAA和HBD的含量。这为糖尿病和脑卒中后早期神经病变的诊断提供了潜在的方法。
    溶菌酶水平在白血病、肺结核、急性细菌感染和炎症性肠病等疾病中升高，唾液溶菌酶的定性和定量测定已用于诊断、治疗和监测此类疾病，Zou等研究证明了适配体检测溶菌酶的可行性。唾液组氨素3（Histatin3，H3）是唾液中一种具有抗真菌活性的多肽，检测H3在唾液中的含量可以反映口腔中念珠菌感染的水平。
    蛋白印迹实验无法检测出H3，色谱法费力耗时且成本昂贵，Ojha等筛选出能与H3特异性结合的适配体LI-H3-APT-3，并将其作为检测唾液中H3水平的生物传感器，灵敏且低成本。唾液中H3水平的测定有助于对口腔念珠菌病和艾滋病的诊断。
    2.2参与疾病治疗
    适配体主要通过两种方式参与治疗：①靶向递送药物；②作为拮抗剂抑制靶标的功能。前者在口腔中的应用目前尚未见报道。
    2.2.1关节炎的治疗
    Sun等发现在由单侧前牙反牙合（unilateral anterior cross bite，UAC）引起的颞下颌关节骨关节炎模型小鼠中，软骨下骨的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）的microRNA-29b（miR-29b）表达水平显著降低，进而通过Wnt5a通路调节使其表现出显著的促进破骨细胞的骨吸收作用。与BMSC特异性结合的适配体aptamer-agomiR-29b能上调miR-29b的表达水平，抑制软骨下骨丢失、破骨细胞功能亢进和软骨降解；而适配体aptamer-antagomiR-29b作用于BMSC则表现出相反的效果，这为治疗颞下颌关节骨关节炎提供了新思路。
    2.2.2癌症治疗
    癌症治疗一直是医学研究的热点，当前大多数治疗癌症的药物主要存在治疗效果不尽如人意和对正常细胞毒性大两个问题。适配体能够靶向识别癌细胞，减少对正常细胞的损伤。
    当前已有3种适配体完成了临床试验。①AS1411：与核仁素外结合域结合，在肺癌、乳腺癌、肾癌和肝癌等临床癌症模型中，显示出抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的能力；②NOX-A12：一种L型RNA适体，可以抑制核酸酶降解，同时也是趋化因子CXCL-12的拮抗剂，可抑制肿瘤细胞增殖、新血管形成和转移；③AGRO100：可与核仁素结合，在肿瘤细胞中具有抗增殖作用。
    乙酰肝素酶是一种内切糖苷酶，参与细胞外基质的降解和重建，与肿瘤转移和组织侵袭有关，是癌症治疗的一个潜在靶点。Simmons等研究发现，抗乙酰肝素酶适配体能够抑制与口腔癌相关肿瘤细胞的组织侵袭，并证实这种作用是乙酰肝素酶受抑制的结果，而非适配体的潜在细胞毒性作用。Sathiyaseelan等将适配体AS1411与5-氟尿嘧啶（5-FU）和阿霉素（Doxorubicin，Dox）结合，通过靶向递送5-FU和Dox用于胶质母细胞瘤的治疗，抑制肿瘤细胞的生长，然而还需要进一步研究这种药物递送系统的有效性。
    适配体通过靶向递送或拮抗靶标功能的方式，与癌细胞特异性结合，抑制癌细胞的生长，减少对正常组织细胞的损伤，具有广阔的前景。但适配体用于癌症治疗的研究尚处于起步阶段，如何保持适配体在体内稳定发挥作用和保证其安全性等问题仍待解决。
    2.3口腔组织再生
    口腔颌面部的骨缺损是口腔外伤常见的并发症，实现颌面部的骨组织再生也是研究的热点之一。Son等在羟基磷灰石（HA）支架表面偶联适配体3R02，开发出Apt-HA这一支架材料，发现其可以通过捕获更多血管内皮生长因子蛋白促进人脐静脉内皮细胞生长，最终促进骨再生和血管生成，是一种有前景的骨移植材料。Ardjomandi等开发了一种以人类颌骨骨膜细胞（human jaw periosteal cells，JPC）为靶标的适配体Aptamer74。
    Aptamer74能够提高JPC的增殖能力以及成骨潜力，将Aptamer74修饰到β-三磷酸钙支架上发现，该支架能够促进细胞的粘附和成骨分化，并且不影响JPC的长期增殖，在口腔颌面外科的组织工程中具有重要作用。
    3.总结与展望
    适配体近年来广泛应用于疾病诊断、药物治疗、靶向递送和组织再生等，是一种具有研究价值和应用前景的生物因子。但在口腔医学领域内，相应适配体的筛选与开发尚处于起步阶段。适配体对靶标的高特异性意味着其在精准诊断、精准治疗上具有很大应用价值，可以精准识别和结合癌细胞相应靶点，减少毒副作用，在癌症治疗中具有巨大潜力。此外，适配体在组织再生领域的研究也有一定的成果。期待更多研究者挖掘适配体在口腔医学领域的潜能，充分发挥适配体的优势，为口腔疾病的诊治提供新的思路。