牙源性干细胞用于治疗神经系统疾病的研究进展

    神经系统疾病包括中枢神经系统疾病和外周神经系统疾病，如脊髓损伤（spinal cord injury）、阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）、脑卒中（cerebral stroke）、慢性脑缺血（chronic cerebral ischemia）和坐骨神经损伤等，给患者、家庭和社会带来极大的心理负担和经济压力，临床上多采用药物治疗与康复训练相结合的治疗方法，但疗效欠佳。
    成熟神经系统缺乏再生神经细胞所必需的前体细胞，因此以间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）为基础的细胞治疗为神经系统疾病的治疗带来了新希望。牙源性干细胞（dental stem cell，DSC）是胚胎神经嵴来源的成体干细胞群，与神经组织同源。与其他组织来源的MSC相比，DSC具有更强的增殖和多向分化能力，且具有获取容易、取材创伤小和免疫排斥反应低等优势，是组织再生的理想干细胞源之一。本文就DSC应用于神经系统疾病组织修复与再生的研究进展进行综述。
    1. DSC的神经向分化能力
    DSC包括牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）、脱落乳牙干细胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）、牙囊干细胞（dental follicle stem cell，DFSC）和根尖牙乳头干细胞（stem cells of apical papilla，SCAP）。
    2000年，Gronthos等从牙髓中分离提取出DPSC，并表明DPSC具有向骨、软骨、脂肪、神经和内皮细胞分化潜能。之后，更多种类的DSC被提取出来。SHED是从脱落的乳牙牙髓中获得，在非神经诱导下，可表达巢蛋白、微管蛋白（β-Ⅲ tubulin） 等神经标志物，这可能与牙髓来源于神经嵴有关。
    SHED在神经特异性诱导条件下培养，不仅表达神经干细胞特异性标志物，同时表达早期和晚期神经元以及神经胶质细胞标志物。PDLSC来源于牙周膜组织，具有分化为外胚层（神经源性）、中胚层（成骨性和成软骨性） 以及内胚层（胰腺） 细胞谱系潜力。
    DFSC来源于未萌出牙齿周围的牙囊滤泡，经神经诱导分化后的DFSC可不同程度地表达晚期神经元标志物如神经丝蛋白。SCAP存在于未发育完成的恒牙根尖周组织中，表达多种神经生长及营养因子，且有体外实验证明SCAP条件培养基能够促进神经突的生长。
    2. DSC 用于中枢神经系统疾病组织修复与再生
    中枢神经系统控制着人体感觉和运动，损伤后会导致严重的神经系统疾病，可导致疼痛、认知或运动功能损伤，严重影响患者日常生活。
    2.1 脊髓损伤
    脊髓损伤是一种严重致残性疾病，可导致运动和感觉功能部分或全部丧失。脊髓损伤的病理生理学变化分为2个阶段，最初以组织破坏为主，如神经细胞和血管的机械损伤，后引起神经炎症反应，如兴奋性毒性、氧化应激和凋亡引起的继发性损伤。DSC移植可降低脊髓损伤大鼠神经元细胞凋亡率，并可分化为成熟神经元，维持神经元存活，通过向少突胶质细胞分化来替代受损细胞，保护神经纤维和髓鞘，促进横断轴突再生，促进脊髓损伤动物神经功能恢复。
    Yang等发现：未分化DPSC移植可以通过抑制白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1） 和Ras同源基因家族成员A的表达减轻炎症反应和促进神经突再生。此外，DPSC可通过降低磺酰脲受体1表达来降低脊髓损伤导致的出血性坏死率。DSC参与神经组织再生除直接替代作用外，与其旁分泌作用亦密切相关。
    研究表明：在完全横断的脊髓模型中存在髓磷脂相关糖蛋白、少突胶质髓磷脂糖蛋白等中枢神经系统髓磷脂和神经胶质瘢痕相关的生长抑制因子，而DPSC分泌的营养因子，如脑源性神经生长因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）等，能够促进轴突再生。含有DPSC的高度血管化支架可通过旁分泌介导的血管生成和神经再生作用，调控脊髓神经损伤修复。
    SHED也具有促进脊髓损伤后运动功能恢复的效果。有学者研究发现：在脊髓损伤大鼠手术后6 h进行SHED移植，可保护神经元免受早期凋亡，有利于脊髓腹角处更多运动神经元存活，并且这种神经元存活可持续至病变后6周；同时，SHED可以减少星形胶质细胞增殖，阻断T淋巴细胞浸润入脊髓实质，降低促凋亡因子肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α） 的表达，使脊髓组织中的线粒体组成蛋白保持正常水平；此外，SHED移植可防止神经元兴奋性氨基酸转运蛋白3和神经元一氧化氮合酶过度表达，对脊髓神经损伤具有保护作用。
    有研究将SHED聚合体联合SHED悬液用于大鼠全横断脊髓损伤模型，结果发现大鼠后肢功能明显恢复，免疫荧光染色显示髓鞘及神经纤维修复再生。应用Basso Beattie Bresnahan运动自评量表对DPSC和SHED以及人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC） 神经再生能力进行评估，结果发现DPSC和SHED组具有更高的评分，表明DSC的神经修复能力比BMMSC更强。
    SCAP在修复脊髓损伤促进功能恢复方面也表现出较大的潜力。SCAP可以减少炎症脊髓组织中TNF-α的表达和分泌，并通过分泌激活素A刺激少突胶质细胞祖细胞分化，证明SCAP在脊髓损伤修复中具有潜在疗效。还有研究报道将SCAP、BDNF与药理活性微载体联合应用治疗大鼠脊髓挫伤，可显著改善大鼠的运动能力，降低诱导型神经元一氧化氮合酶的表达，上调β-Ⅲ tubulin、生长相关蛋白-43和5-羟色胺的表达，从而改善大鼠的运动功能。
    2.2 AD
    AD是一种与年龄有关的神经系统退行性疾病，临床上以记忆力减退，执行功能障碍，语言障碍和认知缺陷以及人格改变和行为损害等全面性痴呆表现为特征。AD病理变化复杂，包括神经元丢失、细胞内神经元纤维缠结和大脑中不溶性β淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ） 肽沉积等。DPSC可以恢复冈田酸诱导的人神经母细胞瘤细胞AD模型的树突断裂、回缩，提升细胞活力并使细胞凋亡水平下降，恢复细胞骨架，减少Tau蛋白磷酸化，进而促进神经元修复和再生。
    将DPSC注入AD大鼠模型海马区，双皮质素、神经元特异核蛋白以及神经丝蛋白-200的表达增加，而Aβ的表达降低，且认知和行为能力得到明显提高。DPSC可分泌BDNF等参与减弱神经毒性的生长因子和细胞因子，降低Aβ肽的毒性作用，分泌降解酶，并下降Aβ肽诱导的细胞凋亡率。
    有研究报道：由于条件培养基中含有干细胞分泌到细胞外的生长因子和外泌体等物质，因此多种干细胞的条件培养基可以有效地针对组织损伤。实验证明：SHED条件培养基能提供多种神经修复作用，如神经保护、轴突伸长、传递神经递质、抑制免疫炎症、调节小胶质细胞等，同时减弱了Aβ肽诱导的促炎症反应，诱导小胶质细胞向抗炎M2型巨噬细胞样极化，将促炎微环境转化为抗炎微环境，从而有利于AD的治疗。
    2.3 帕金森病（Parkinson’s disease，PD）
    PD也是一种神经退行性疾病，由黑质致密部多巴胺能神经元变性和死亡引起，临床主要表现为肌肉强直、静止时手抖、运动迟缓和难以姿势平衡。体外培养表明：DPSC具有分化为多巴胺能神经元样细胞的潜能。DPSC可以通过下调促炎细胞因子如TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-1β等，上调抗炎细胞因子如TNF-β、IL-2和IL-4来保护多巴胺能神经元功能并促进行为障碍恢复。
    在炎症诱导下多巴胺能样神经元与小胶质细胞共培养的PD体外模型中，DPSC通过减少多巴胺能神经元的DNA损伤，抑制小胶质细胞的增殖，减少活性氧和一氧化氮的产生，从而提高神经免疫调节活性。同样，SHED也具有促进PD模型功能恢复的作用。实验证明，内侧前脑束单侧鼻内注射SHED外泌体能有效减缓PD大鼠的运动障碍。将经过神经诱导的SHED移植到PD大鼠纹状体中，能够有效地分化为神经元和多巴胺能神经元并明显改善PD大鼠的运动功能。
    2.4 脑卒中
    脑卒中是一种急性脑血管疾病，分为缺血性和出血性脑卒中，是由脑血管突然的爆裂或阻塞而导致脑血流中断的脑血管破坏性疾病，可引发身体多重功能损伤。缺血性脑卒中的发生率高于出血性脑卒中，占卒中总数的60%~70%且极易致残、致死。脑缺血可以引发多种病理生理过程，包括血管性水肿、兴奋性毒性、血脑屏障破坏、氧化应激、脑部炎症和神经元死亡等。
    由于缺乏确切的治疗手段，目前仍以预防为主。干细胞疗法可能为脑卒中的治疗提供一种新的治疗策略。将DPSC移植到大鼠大脑中动脉闭塞缺血区域，DPSC可迁移至缺血区边界并表达神经细胞及神经干细胞标志物，减少梗死面积并减轻脑水肿。与BMMSC相比，静脉移植DPSC可在大鼠模型中实现相似的功能恢复，并明显减少梗死面积；同时，由于DPSC具有高度血管生成和神经元分化能力，可以减少体内反应性神经胶质细胞数量，通过自分泌/旁分泌机制在体外保护受损星形胶质细胞靶向迁移，促进DPSC血管生成潜力。
    用PKH26 染色示踪干细胞迁移，比较DPSC和PDLSC对脑卒中的治疗效果，结果发现：PDLSC组PKH26荧光标记信号显示更为明显，并且显著促进了神经功能的恢复。过表达干细胞生长因子的DPSC在脑卒中急性期可以调控炎症反应和血脑屏障通透性，增强其神经保护作用，防止缺血/再灌注后脑损伤。
    2.5 视网膜和视神经损伤
    视网膜是一个复杂结构，由感光细胞、双极细胞和视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC） 组成，位于视网膜色素上皮的顶部，视网膜和视神经都是中枢神经系统组成部分。外伤或青光眼等致RGC缓慢丢失可导致失明，而视网膜和视神经损伤的修复和再生能力有限。DPSC具有较高的神经营养因子表达水平，与RGC共培养时可显著促进RGC存活和其神经突再生，且相比于BMMSC，移植DPSC所引起的神经保护和促进轴突再生作用更为显著。
    在青光眼的动物模型中，眼内压升高导致RGC进行性丧失，玻璃体腔内移植DPSC可通过保护RGC并维持治疗后的视觉功能长达35 d。在大鼠视神经损伤的玻璃体内移植PDLSC，其β-Ⅲ tublin和生长相关蛋白-43的阳性表达升高，提示存活的RGC和再生轴突的数量显著增加。将PDLSC和视网膜外植体体外共培养，通过直接的细胞间相互作用和增加BDNF分泌，PDLSC可以增强视网膜外植体中的RGC存活和神经突再生。尽管体外研究显示诱导条件下DPSC可分化为RGC样细胞和感光细胞，但是否可分化为真正的RGC和功能性细胞并成功整合至视网膜以恢复视力尚未可知。
    2.6 慢性脑缺血
    慢性脑缺血是由于各种原因引发的长期脑血流灌注不足所致，被认为是神经系统疾病和脑血管疾病，可表现为进行性的学习、记忆与空间信息处理能力下降，最终造成认知功能障碍。慢性脑缺血在血管性痴呆、脑梗塞、脑动脉硬化和AD等多种神经系统疾病的发生发展过程起着重要的作用。慢性脑缺血所涉及的机制可能与氧化应激、细胞凋亡、炎症反应、突触功能障碍和能量代谢紊乱有关。
    目前，慢性脑缺血的治疗方法主要为药物治疗及手术干预等，然而即使最有效的神经保护药物也无法逆转其神经元损伤。近年来，MSC在神经系统疾病治疗中显示出具有巨大的应用前景。有研究表明：人羊水干细胞、脂肪源性干细胞及BMMSC，在改善缺氧缺血性脑部疾病的功能障碍中展现出极大优势。但是，临床上这些干细胞获取困难，增殖率低且神经向分化不良，应用于神经系统疾病治疗存在一定局限性。而DSC具有来源广泛、获取容易、增殖能力强和极低的免疫源性等优势，成为极具应用前景的干细胞源。
    Zhu等报道：SHED移植可以通过降低慢性脑缺血大鼠海马区神经元凋亡，恢复海马区神经元数量，并增强海马区神经功能相关蛋白表达水平，从而改善慢性脑缺血大鼠的认知障碍。
    有学者发现：DPSC表达胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF-1R），DPSC分泌的胰岛素样生长因子1通过自分泌信号通路与IGF-1R相互作用，以保持自我更新和增殖潜力。经过免疫分选后，阳性表达IGF-1R的DPSC可促进神经可塑性，并通过增加抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2的表达来改善神经预后、增强神经发生和血管生成。此外，阳性表达IGF-1R的人DSC能够促进缺氧/缺糖条件下的神经轴突再生，显著减少促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的表达。
    3.DSC 用于外周神经系统疾病组织修复与再生
    外周神经损伤主要是由事故创伤或手术导致并发症引起的，可导致感觉障碍、瘫痪和残疾，严重影响患者日常生活。外周神经损伤的常规手术治疗往往选择端对端的神经缝合术。自体神经移植是治疗外周神经损伤的金标准疗法，但具有损伤供体部位导致供体部位瘫痪和免疫排斥等缺点。而组织工程化外周神经再生技术中，种子细胞、支架及构建技术起到至关重要的作用。
    3.1 坐骨神经损伤
    DPSC可以在体外分化为Schwann细胞，将这些分化的DPSC移植到大鼠15 mm坐骨神经缺损部位后形成有髓神经纤维和内生神经突。另有研究显示：免疫筛选出的STRO-1+/c-Kit+/CD34+DPSC可通过分化为Schwann细胞前体和分泌神经营养因子，促进坐骨神经损伤模型的周围神经再生和再髓鞘化。
    有学者将10% GelMA水凝胶、重组人碱性成纤维细胞生长因子和DPSC，加入纤维素/大豆分离蛋白复合膜管用于修复大鼠坐骨神经缺损，12周后组织学上显示再生神经元、Schwann细胞等神经组织和有髓神经纤维，且大鼠坐骨神经功能得到恢复，并且几乎所有缺损部位新形成的神经组织都是由外源性DPSC直接分化而来。
    将DPSC移植到多神经病变的糖尿病裸鼠后肢骨骼肌内4周后，小鼠的感觉障碍、神经传导速度延迟及坐骨神经血流量减少等状况得到明显改善；且移植到骨骼肌的DPSC定位于肌束周围，产生新生血管和神经营养因子。
    3.2 面神经损伤
    面神经含运动、感觉和副交感神经纤维，面神经损伤会导致患者出现功能和心理障碍，药物和手术治疗的效果均不佳。Sasaki等使用含有DPSC的硅胶管固定面神经病变区，在功能和神经电生理方面都证明DPSC可以促进面神经再生。在大鼠面神经压迫损伤后立即应用未成熟DPSC，可在2周后起到促进神经保护和髓鞘再生的作用。
    有学者将DPSC悬液用于兔面神经上颊支损伤模型，结果发现面部胡须运动功能的评分升高，他们认为可能与DPSC分泌和表达BDNF及睫状神经营养因子有关。还有研究表明：自体神经移植联合SHED和聚乙醇酸导管用于修复大鼠面神经下颌支切断模型，通过评估复合肌动作电位和轴突直径证明面神经下颌支再生，且SHED在移植后6周内整合并在神经组织中存活，分化为Schwann样细胞。
    4. DSC 治疗神经系统疾病的应用方式
    尽管使用DSC在治疗神经系统疾病方面具有替代受损细胞、分泌神经营养因子等优势，但由于中枢神经系统损伤后缺乏生长因子供应、生长抑制因子增多及瘢痕组织形成等阻碍神经再生，且长段周围神经缺损再生能力有限，DSC在神经系统疾病的治疗方面仍面临一些挑战。
    目前，MSC的应用方式主要为局部应用（原位注射） 和系统应用（静脉注射），就MSC的输送效率而言，局部注射途径比静脉注射途径更有效。MSC移植可促进神经系统修复，但是单纯MSC移植存在移植细胞存活率、定植率较低等问题。组织工程支架可以提供一个三维空间，为移植MSC提供有效支持，促进其在体内黏附、增殖和分化。
    DSC与生物材料的联合应用为神经修复与再生提供了广阔前景。最常见的生物材料是壳聚糖、聚己内酯和聚乳酸聚乙醇酸共聚物、硅胶管和肝素-泊洛沙姆水凝胶等。近年来，脱细胞支架也被用于组织修复与再生。由于生物材料在组织再生中被广泛使用，随着研究的深入，嵌入了神经营养因子的3D生物材料支架与神经诱导的DSC联合应用有望成为神经修复与再生的理想工具。
    5.小结与展望
    DSC可通过细胞替代、旁分泌作用、血管生成、突触形成、免疫调节和减少凋亡等机制介导神经修复与再生。但DSC真正应用于临床仍面临诸多挑战，例如，细胞分离和培养及保存方法尚缺乏金标准，存在遗传物质变异和伦理问题等；DSC具有向目标细胞分化、产生和分泌神经营养因子的能力，但同时DSC也具有异质性，每一种类型的DSC都包含几个亚群，各亚群有其自身特点，如某些亚群倾向于成骨分化，而另一些则倾向于神经分化，目前还没有有效的方法进行分类；同时，DSC的生物学性能受传代次数影响，且不同损伤处的微环境对DSC的影响不同，而应用的细胞代次、细胞数量及移植时间尚未规范化。
    在疾病治疗中如何调控干细胞向目标细胞分化，“规范”干细胞归巢和免疫调控作用还有待深入研究。此外，干细胞移植是否存在致瘤性一直是学者们争论的热点，近年来干细胞外泌体、微囊泡等无细胞治疗研究为干细胞的应用提供了新的策略，但无细胞治疗在神经系统疾病的研究较少，仍需进一步探索。
    支架材料作为组织工程三要素中必不可少的一部分，近年来也备受关注，何种材料更适用于神经组织再生，以及如何整合各种生物材料的优势，有效促进神经修复与功能重建也是现阶段研究的热点。干细胞治疗从基础研究、临床研究到神经系统疾病治疗的转化并非一蹴而就，随着科学技术和生物材料的进一步发展，基于DSC优秀的干细胞性能和临床应用价值，DSC治疗神经系统疾病将具有广阔的应用前景。