非编码RNA调控牙囊干细胞成骨分化的研究进展

    牙周炎、先天性畸形、颌面部外伤、感染和肿瘤等均会导致不同程度的牙槽骨缺损，造成颜面部畸形的同时，对咀嚼、吞咽、语言等功能也产生严重影响。目前，临床上牙槽骨缺损的治疗方法（引导性组织再生、自体骨移植等）存在各种局限性，比如组织再生有限、供体不足、供骨区并发症等，尚无法获得理想的牙槽骨再生效果。因此，牙槽骨缺损的再生治疗成为口腔领域的研究热点和难点。
    近年来，牙周组织工程技术为牙槽骨缺损的结构再生和功能重建提供了全新的思路和路径，其需要理想的种子细胞、安全可降解的支架材料和适宜的微环境。牙囊干细胞（dental follicle stem cell，DFSC）起源于神经嵴细胞，具有自我更新和多向分化潜能，是牙周组织的直接前体细胞，能分化为成骨细胞、牙周膜细胞和成牙骨质细胞，在牙周组织发育中发挥不可或缺的作用；体外DFSC在特定条件下可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经元、唾液腺细胞、导管细胞、心肌细胞等。
    此外，DFSC易于获取和保存，相比于骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）及其他牙源性干细胞，具有更好的增殖分化能力以及免疫调节作用，是目前极具开发前景的种子细胞。探索DFSC成骨分化机制是牙周组织工程的前提和基础。随着微阵列技术和高通量测序技术的发展，非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）的重要作用不断为学者所认知。ncRNA是一类基因组DNA转录而来但缺乏编码或翻译蛋白质能力的RNA，通过与蛋白质、DNA、RNA等分子相互作用调节靶基因的表达，在表观遗传、转录及转录后水平发挥生物学功能。
    表观遗传调控狭义上一般是指在DNA序列不发生改变的情况下，通过调整染色质状态从而实现对基因表达的调控，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑等。转录调控是指对包括转录起始、延长、终止在内的转录过程的调控，包括转录因子、增强子等。转录后调控是指对基因转录产物进行一系列加工、修饰等过程，包括mRNA前体选择性剪切、mRNA稳定性调节、RNA干扰等。目前研究证实：ncRNA可多水平调控DFSC成骨分化，在基因调控网络中扮演着重要的角色。
    1. ncRNA概述
    高通量转录分析表明：高达90%的真核生物基因组被转录，而仅1%~2%的转录产物（RNA）具有蛋白质编码能力，其余不编码蛋白质的转录本被称为ncRNA，最初被认为是“转录噪音”。但近年来大量的研究表明：ncRNA是基因调控网络的重要组成部分，参与许多生理和病理过程，包括发育、免疫应答、应激反应、干细胞调控、疾病发生等。
    转录ncRNA的DNA序列包括蛋白质编码基因、增强子区域和转座子元件，ncRNA根据功能可分为管家ncRNA （house keeping ncRNA）和调控ncRNA（regulatory ncRNA）。管家ncRNA通常很小，大小为50~500 nt，组成性表达于所有细胞类型，主要调节细胞的一般功能，为细胞生存所必需，包括参与蛋白质合成的核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）和转运RNA（transferRNA， tRNA），RNA剪接中的小核RNA （smallnuclear RNA，snRNA）和RNA修饰中的小核仁RNA（small nucleolar RNA， snoRNA）。
    调控ncRNA通常在特定细胞中特异性表达，在基因调控网络中发挥关键的调控作用，根据其大小可进一步分为小型ncRNA （<200 nt）和长链ncRNA（long non-coding RNA， lncRNA）（>200 nt），前者包括微小RNA（microRNA，miRNA）、小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）、piwi相互作用RNA （piwi-interacting RNA，piRNA）。一部分长度可变的ncRNA可能同时属于两类，比如启动子相关转录本（promoter-associated transcript，PAT）、增强子RNA（enhancer RNA，eRNA）和环状RNA（circular RNA，circRNA）。目前，研究较多的ncRNA主要是miRNA、lnc-RNA和circRNA这三类调控ncRNA。
    1.1 miRNA的形成与作用机制
    miRNA是一类在植物、动物和病毒中广泛表达的ncRNA，大小为21~24 nt，在进化上表现出高度的保守性。miRNA （lin-4 locus2）于1993年在秀丽隐杆线虫中被发现，随后，哺乳动物中的miRNA （Let-7）于2000年被发现。在哺乳动物中，miRNA可控制约50%蛋白质编码基因的活性，几乎参与了所有细胞过程的调控。
    miRNA的合成开始于细胞核中的转录，然后到细胞质中进一步加工和成熟。在细胞核中，独立的miRNA基因或蛋白质编码基因内含子序列被RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ）转录成初级转录本（primarymiRNA，pri-miRNA），然后再被Drosha（RNase Ⅲ家族）和DiGeorge综合征关键区域8（DiGeorge syndrome critical region 8，DGCR8）微处理器复合体切割形成含有发夹结构的约70 nt的前体miRNA（precursor miRNA，pre-miRNA）；exportin 5-RanGTP穿梭系统将pre-miRNA输出到细胞质，被Dicer （RNase Ⅲ家族）加工成约20 nt的miRNA/miRNA*双链体，其中成熟的miRNA链[又叫引导链（guide strand）]整合到RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），通过与靶基因mRNA 3’非翻译区（3’untranslatedregion，3’UTR）碱基配对，促进mRNA降解或抑制蛋白质翻译进而沉默基因表达，在转录后水平调节生物学过程，而miRNA*链[又叫过客链（passenger strand）]则大多被降解。
    生物信息学研究显示：单个miRNA可以靶向至少数百个基因，且一个基因由多个miRNA调控，这使得miRNA在复杂的基因调控网络中发挥核心作用。miRNA是干细胞生物学行为的关键调控因子，敲除参与miRNA形成的关键蛋白DGCR8的干细胞在分化方面存在缺陷。
    1.2 lncRNA的形成与作用机制
    lncRNA是一类长度大于200 nt的调控ncRNA，来源于基因间和重叠蛋白编码区，几乎不具有蛋白质编码能力。lncRNA保守性较低，但具有高度的组织特异性。根据其结构和位置可分为5类：1） 反义lncRNA； 2） 基因间lncRNA； 3）有义重叠lncRNA；4） 有义内含子lncRNA；5） 加工过的转录本。
    lncRNA以往被认为是RNA PolymeraseⅡ转录的无功能副产物，但近期研究显示lncRNA参与多种生物学过程，包括染色质修饰、转录调节、细胞分化、增殖、凋亡、器官形成、疾病发展等。lncRNA定位在细胞核或细胞质中，其功能取决于亚细胞定位。
    lncRNA能够折叠成独特的二级构象，包括DNA结合结构域、RNA结合结构域和蛋白质结合结构域，充当支架、诱饵、信号和向导，与DNA、RNA和蛋白质形成广泛的调控网络，在表观遗传、转录和转录后水平调控基因表达：
    1） 在表观遗传水平上，lnc-RNA通过组蛋白修饰、DNA甲基化和染色质重塑调节染色质结构；
    2） 在转录水平上，lncRNA可通过结合转录因子（transcription factor，TF）、干扰临近基因转录，或通过与RNA结合蛋白（RNAbinding protein，RBP） 相互作用并靶向启动子调节基因表达；
    3） 在转录后水平上，lncRNA作为miRNA“海绵”，减弱miRNA介导的靶基因调控。lncRNA还可在转录后水平通过与蛋白形成lncRNA-蛋白质复合物（lncRNA-protein complex，lncRNP），或与其他RNA配对募集参与mRNA降解的蛋白质，调节基因表达。许多定位于细胞器（比如外泌体、线粒体）的lncRNA还可调节细胞器功能。
    1.3 circRNA的形成与作用机制
    circRNA是一类具有独特共价闭环结构的调控ncRNA，在pre-mRNA成熟期间通过反向剪接产生，于1976年由Sanger等提出。circRNA广泛存在于哺乳动物细胞内，在进化上具有比miRNA更高的保守性，且具有组织特异性和时空特异性。circRNA主要定位于细胞质，相比于线性RNA，circRNA形成共价闭合环，无3’和5’末端，对核酸外切酶RNaseR有抵抗力，具有更好的稳定性。
    根据形成机制，circRNA可分为外显子circRNA、内含子circRNA、基因间circRNA、有义重叠circRNA和反义circRNA五类。circRNA作为一类新型的保守内源性ncRNA，在转录水平和转录后水平发挥功能：1）与RBP结合形成RNA-蛋白质复合物（RNA-protein complex，RPC），调控线性基因的转录；2）充当miRNA“海绵”；3）含有内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES 的合成cirRNA可翻译成蛋白质。随着技术的发展和研究的深入，最初被认为是异常剪接副产物的circRNA不断被报道参与基因表达的调控和某些疾病的发生。
    2. DFSC 的成骨分化
    牙囊（dental follicle，DF）是来源于外胚间充质的疏松结缔组织，在牙齿发育期间包绕成釉器和牙乳头。Morsczeck等在体外从人第三磨牙的DF中分离出DFSC。牙囊组织通过组织块法、酶消法或两者结合可获得牙囊细胞（dental follicle cell，DFC），而后经过多次差速传代纯化；纯化的DFC通过有限稀释法可分离并单克隆扩增DFSC，相较于DFC，DFSC表现出增强的增殖能力。
    DFSC 表达间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）标志物、胚胎干细胞标志物和神经干细胞标志物，但不表达造血干细胞标志物。在含抗坏血酸、β-甘油磷酸和地塞米松的培养基中，DFSC可诱导分化为成骨细胞，表现为成骨相关标志物上调，如runt相关转录因子2 （runt-related transcription factor 2，RUNX2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型胶原（collagen type-1，COL1）、骨桥蛋白（osteopontin， OPN）、骨唾液蛋白（bone sialoprotein，BSP）、成骨相关转录因子抗体（osterix） 和同源转录因子5 （distal-less homeobox-5，DLX-5）。
    动物实验证实，DFSC具有体内成骨能力，将DFSC与支架材料结合植入体内可修复大面积骨缺损。Rezai-Rad等将接种DFSC的聚己内酯（polycaprolactone，PCL）支架植入到大鼠临界骨缺损（critical-sized bone defect，CSD）处，可实现约50%的骨再生。
    Nie等将接种骨形成蛋白9重组腺病毒（recombinant adenoviruses expressingBMP9，Ad-BMP9）转染DFC的珊瑚羟磷灰石（coralline hydroxyapatite，CHA） 支架植入大鼠牙槽骨缺损模型，在6周后观察到显著的新骨形成。在炎症环境下，DFSC相比牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC） 表现出更为强大的适应能力和牙周组织再生能力。因此，DFSC作为理想的种子细胞，在牙周组织工程中具有广阔的应用前景。然而，DFSC的成骨分化需要适宜的微环境，在没有相关生物活性分子的诱导下其不能矿化或形成骨组织。
    自从DFSC成功分离以来，许多学者致力于其成骨潜能的研究。DFSC的成骨分化机制复杂，受多种因素的调节，包括细胞间相互作用、细胞因子，涉及复杂的信号通路。人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）或Hertwig上皮根鞘细胞（Hertwig’s epithelial root sheath cell， HERSC）与DFSC或DFC共培养时，成骨分化能力显著增强；BMP9、BMP6、牙源性成釉细胞相关蛋白（odontogenic ameloblast-associated protein，ODAM）、牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein1，DMP1）等促进DFSC成骨分化；Wnt/β-catenin信号通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信号通路等参与DFSC的成骨分化。
    以往对DFSC成骨分化机制的研究多聚焦于TF和细胞外基质（extracellularmatrix，ECM） 蛋白。近年来的相关研究证实，ncRNA是DFSC成骨分化基因调控网络中至关重要的信号分子，以BMP为代表的成骨分化上游启动因子，以RUNX2为代表的下游成骨分化相关标志基因等均受到ncRNA的调控。
    3. miRNA 与DFSC 成骨分化
    3.1 miRNA在DFSC中的表达特点
    miRNA的调控表现出明显的组织和细胞特异性，不同组织来源的干细胞具有其独特的miRNA表达谱。Ogura等比较MSC 和DFC 的miRNAmRNA表达谱，miR-196-a、-b和miR-10-a、-b仅在MSC中高表达，而miR-20a*、miR-129-3p 和miR-19b-1*仅在DFC中高表达，且miRNA的表达水平与相关靶基因在两种干细胞的表达水平一致，表明miRNA的组织特异性表达影响不同组织的特征性mRNA表达，提示miRNA-mRNA表达谱可用于表征组织类型和作为细胞特异性标志物。
    同样，与3T3细胞、BMSC和脂肪干细胞（adipose stemcell，ADSC） 成骨细胞分化相关的miRNA （如miR-26a、miR-125b和miR-20a） 在DFSC中并未差异表达。
    3.2 miRNA调控DFSC成骨分化
    DFSC成骨细胞分化过程中多种miRNA上调或下调，这些miRNA通过靶向TF、信号分子等参与调控成骨分化。其中，miRNA更加倾向于靶向TF，同时又更多地受到TF的调节，两者之间构成相互联系的调控网络。同时，miRNA协调成骨相关信号通路，在复杂的调控网络中发挥重要的核心作用。
    3.2.1 正向调控DFSC成骨分化的miRNA
    miR-101：Klingelhöffer等发现miR-101在hDFSC成骨分化过程中上调，miR-101-mimic转染增加ALP活性，成骨相关转录因子SP7显著上调，表明miR-101正向调控DFSC成骨分化；miR-101调节与癌细胞增殖和凋亡相关基因，而转录因子DLX3调节DFSC的细胞增殖和凋亡，且参与成骨分化，推测BMP2/DLX3信号通路作为RUNX2和SP7的上游通路，可能是miR-101调控DFSC成骨分化的重要靶点，但具体的机制有待进一步实验证实。
    3.2.2 负向调控DFSC成骨分化的miRNA
    miR-29：Tomoki等研究hDFC成骨分化过程中miRNA的表达谱发现，miR-29 （miR-29a、-29b和-29c）在成骨分化过程中显著下调；进一步研究显示miR-29以COL1 （矿化组织的主要ECM）为靶点，抑制成骨分化，其中以miR-29b的抑制作用最为强烈。
    miR-146a：RUNX2作为成骨细胞特异TF，影响细胞的生物学行为，其中RUNX2突变是颅骨锁骨发育不良（cleidocranial dysplasia，CCD）患者乳牙滞留和恒牙迟萌的原因。
    Chen等研究了RUNX2与miRNA对DFSC分化的影响，RUNX2突变的hDFSC表现为更长、更大的细胞形态，降低的增殖活性以及增强的成骨分化能力；微阵列分析显示RUNX2突变影响多个miRNA的表达，其中miR-146a 在RUNX2 突变DFSC 中显著降低；当miR-146a过表达或抑制时，RUNX2、骨保护素（osteoprotegrin，OPG）、EGFR和集落刺激因子-1（colony stimulating factor 1，CSF-1）的表达变化显著，EGFR是miR-146a的潜在靶基因，EGFR参与调节成骨分化过程中RUNX2的表达，提示RUNX2基因与miRNA之间的相互作用可能是DFSC成骨分化的关键调控机制之一。
    miR-204：Ito等的研究发现hDFC成骨分化过程中miR-204表达降低，miR-204的转染降低了ALP活性以及SPARC和RUNX2的蛋白水平，同时伴随三者mRNA水平的降低，表明miR-204通过靶向RUNX2、ALP和SPARC负向调控hDFC的成骨分化。
    miR-335：左婕等的研究显示rDFSC体外诱导成骨分化过程中miR-335下调，miR-335负向调控DFSC的成骨分化。miR-335在未分化人间充质干细胞（human mesenchymal stem cell， hMSC）中高表达，在成骨分化过程中发生下调，miR-335直接靶向RUNX2的3’UTR抑制其表达，同时miR-335的表达又受到经典Wnt信号通路的调控。而miR-335-5p通过下调Wnt通路拮抗剂Dickkopf相关蛋白1 （Dickkopf-related protein 1，DKK1） 激活Wnt信号通路，参与MSC成骨分化。Wnt信号通路同样是DFSC成骨分化中的重要信号通路，包括经典Wnt/β-catenin信号通路和非经典Wnt信号通路，提示Wnt信号通路可能参与miR-335对DFSC成骨分化的调控。
    miR-214：王智亨等发现miR-214过表达的rDFSC伴随β -catenin 表达水平的下调， 并抑制ALP、骨粘连蛋白（osteonectin，OSN） 及RUNX2的表达，抑制成骨分化。miRNA通过靶向相关基因，与成骨相关信号通路相互作用，同时又受其调控，在基因调控网络中发挥重要的核心作用。由于miRNA体积小，容易传递到细胞中，被认为是未来治疗牙槽骨缺损的潜在方法。但是目前许多对miRNA和DFSC成骨分化的研究仅仅停留在功能层面，或只是运用生物信息学预测靶基因，对调控机制的研究需要进一步的实验验证。
    4. lncRNA 与DFSC 成骨分化
    4.1 lncRNAMEG3
    MEG3是母系表达的lncRNA，位于人类染色体14q32.3区域DLK1-MEG3印记位点。研究显示，hDFC中的lncRNAMEG3显著低于人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLC），lncRNA MEG3在胚胎发生和发育上发挥重要作用，MEG3耗尽伴随着DFSC多能性相关基因的转录减少，表明MEG3在DFSC多能性中可能发挥重要的调节作用。进一步的研究发现，lncRNAMEG3定位于细胞质，与zeste基因增强子同源物2 （enhancerof zeste homolog 2，EZH2） 相互作用，下调MEG3 或EZH2 降低Wnt 基因启动子上的H3K27me3水平，在表观遗传水平上激活Wnt/β -catenin信号通路，进而促进DFSC的成骨分化。
    4.2 lncRNA HOTAIRM1
    lncRNA HOTAIRM1是位于同源异形盒A1/2（homeobox A1/2，HOXA1/2） 基因间区的反义转录物，Chen等的研究发现lncRNA HOTAIRM1和HOXA2在hDFSC中的表达显著高于hPDLSC，两者具有相似的表达模式，进一步研究证实lncRNAHOTAIRM1 通过抑制DNMT1 表达以及其在HOXA2启动子区域的富集，维持HOXA2启动子的低甲基化水平，促进HOXA2的转录和表达，进而促进DFSC的成骨分化。
    4.3 其他可能参与DFSC成骨分化的lncRNA
    hDFC显示出比hPDLC更优的胚胎特性，包括多能性和异质性，微阵列检测显示845个lncRNA在两者中差异表达，包括lncRNA NR_033932、lncRNARGMB-AS1、lncRNA T152410、lncRNAENST00000540293等，表明lncRNA在DFC分化中可能起关键作用，lncRNA RGMB-AS1可能通过调节细胞周期来促进DFC的迁移、增殖和分化；lncRNAENST00000540293可能通过调节邻近基因的表达促进DFC存活和分化；lncRNA uc021sxs.1和lncRNA ENST00000609146可能通过调节mRNA表达而参与相关的信号传导途径（比如Wnt信号通路），调节DFC的成骨分化。但这些差异表达的lncRNA主要基于生物信息学分析，具体的作用机制有待进一步深入探究。
    lncRNA数量庞大且作用机制复杂，目前关于lncRNA与DFSC成骨分化的研究较少，仅阐述了lncRNA在表观遗传水平调控DFSC成骨分化的机制，对转录和转录后水平的调控机制至今仍无涉及，需要更多的研究来丰富对DFSC调控网络的认知。
    5. circRNA与DFSC成骨分化
    circRNA参与协调成骨相关的分子和信号通路，在成骨分化过程中发挥重要的调控作用。circRNA通过靶向miRNA，与Wnt/β-catenin、MAPK、BMP信号通路中的mRNA相互作用，调控成骨分化。研究发现：DFSC成骨分化过程中circFgfr2充当miR-133的“分子海绵”，抑制miR-133表达，使下游BMP6基因表达增强，促进DFSC的成骨分化。
    目前关于circRNA调控成骨分化主要集中在充当“分子海绵”方面，但关于circRNA-miRNA mRNA调控网络的确切机制尚不清楚。此外，circRNA在基因调控网络中的作用机制复杂，是否能通过直接与RBP结合调节基因转录或直接翻译成蛋白质来调控成骨分化仍是个未知数。关于circRNA调控DFSC成骨分化机制的研究尚处于起步阶段，需要更多地挖掘DFSC成骨相关circRNA并进一步探究其作用机制。
    6.总结与展望
    miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA和TF之间相互作用，协调多种信号通路，构成复杂而精准的基因调控网络，参与DFSC的成骨分化调控。DFSC作为牙周组织工程理想的种子细胞，明确ncRNA在DFSC成骨分化中的角色和作用机制，对实现牙周组织再生和功能重建具有重要意义。
    虽然关于ncRNA在DFSC成骨分化过程中的认识尚只是冰山一角，部分研究仅仅在功能上阐述了促进或抑制成骨分化，但是ncRNA的关键调控作用不容忽视。因此，需要借助生物信息学方法和基因组学技术深入挖掘ncRNA的功能，并进一步探索其调控机制，丰富基因调控网络，以期实现对DFSC成骨分化的精准调控，为干细胞的再生治疗提供新的策略。随着ncRNA重要作用和DFSC成骨分化机制的不断被揭示，牙周组织工程有望广泛应用到临床治疗当中。