间充质干细胞源性外泌体在颞下颌关节骨关节炎中的研究进展

    颞下颌关节骨关节炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是以进行性软骨退化、软骨下骨改建、滑膜炎和慢性疼痛为特征的退行性颞下颌关节病。由于关节软骨的自愈能力有限，使其成为治疗最困难的关节疾病之一。
    目前对于TMJOA的治疗策略旨在防止软骨和软骨下骨的逐渐破坏，诱导骨重塑，缓解关节疼痛，并恢复颞下颌关节功能。传统的临床治疗方法可以在一定程度上防止疾病的发展，但是它们不能完全恢复退化的软骨或软骨下骨损伤。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）在关节软骨修复治疗中具有巨大潜力。MSC通过分泌多种营养因子来调节受损组织的环境，并协调后续的再生过程，包括细胞增殖、分化以及基质合成，而外泌体在其中发挥重要作用。
    研究表明，间充质干细胞源性外泌体（mesenchymal stem cells exosome，MSC-Exo）能够转导细胞间信号、调节微环境和炎症免疫，促进损伤组织再生，如软骨和骨再生，因此MSC-Exo有望成为治疗TMJOA的一种新方法。本文就MSC-Exo在TMJOA治疗过程中的潜在作用进行综述。
    1.MSC及MSC-Exo的概述
    干细胞具有自我更新和分化成多种细胞系的潜能。根据其发生来源，干细胞可分为3大类：胚胎干细胞、诱导多功能干细胞和成体或体细胞干细胞，MSC属于成体干细胞。MSC最初是由Friedenstein等从骨髓组织中分离出来，具有分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的能力。
    在多种干细胞来源中，MSC与其他祖细胞相比具有以下优势：（1）相对容易地从外周血、骨髓和脂肪等各种组织中提取；（2）分离和培养成本低；（3）具有免疫抑制能力；（4）可进行同种异体移植和自体移植患者的多种治疗。但是MSC也存在着分离、采集和运输要求条件高、体外培养易衰老以及增殖能力有限等问题，因此在一定程度上限制了其在临床上的应用。最初学者们推测MSC主要通过直接分化为软骨细胞来替代损伤组织，但近年来的研究表明，其使组织修复与再生的机制可能依赖于旁分泌。
    2010年，Serena等证实了MSC通过旁分泌及内分泌途径分泌囊泡样细胞结构参与组织修复与再生，并将其命名为间充质干细胞外泌体（MSC-exosomes）。外泌体是一种直径为30~140nm的存在于细胞外的多囊泡体，具有脂质双层膜，含有丰富的生物分子，包括蛋白质、脂质和核酸。
    外泌体的形成包括3个阶段：（1）细胞膜的内卷形成内体；（2）内体膜向内萌出形成管腔状囊泡，内体成为具有动态亚细胞结构的多囊泡体（MVBs）；（3）通过MVBs和质膜的融合将外泌体分泌到细胞外空间。外泌体的主要作用被认为是作为细胞间通讯的载体，并将生物活性物质如蛋白质、脂质和核酸（mRNA和miRNA）转移到受体细胞，从而诱导受体细胞产生生物反应，其发挥生物学功能主要包括以下两种方式：（1）与受体细胞膜融合或直接被内吞，释放其内的生物活性分子如蛋白质、脂质和核酸；（2）通过配体-受体结合途径激活受体细胞信号转导通路，从而调节疾病微环境。
    近年来，MSC-Exo已被鉴定为细胞间信息交流的潜在载体，由于其免疫反应低，临床安全性高，易于从广泛的组织中提取，以及治疗扩展性的高潜力，因而在基础医学与临床医学领域中得到越来越多的关注。
    2. MSC-Exo在TMJOA治疗中的潜在机制
    在病理条件下，MSC的营养调节具有抗炎和免疫调节作用，而MSC-Exo能够模仿MSC的主要治疗作用，包括影响免疫效应细胞的活性，抗炎、免疫调节及促进组织修复和再生。MSC-Exo可以通过恢复受骨关节炎影响的区域的稳态来促进软骨修复和再生。目前MSC-Exo的软骨再生机制尚未明确，但其对TMJOA产生修复再生作用的潜在机制可能与细胞的数目、软骨细胞的新陈代谢、细胞能量平衡、免疫调节等有关。
    2.1 恢复细胞数目
    骨关节炎（osteoarthritis，OA）区域的细胞死亡是其重要的病理特征，其原因主要包括细胞凋亡、炎症反应、线粒体功障碍和氧化应激等。炎症反应通常会加剧受损的软骨损伤，进而导致基质降解，细胞死亡，OA结构改变以及功能丧失。适当数量的细胞对于维持组织结构和恢复受损区域的功能很重要。
    在受损的软骨组织中，MSC-Exo可通过腺苷介导的激酶磷酸化诱导细胞增殖。当组织由于机械负荷等原因而受到损伤时，细胞会发出危险信号如三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），刺激免疫原性细胞清除受损或濒临死亡的细胞。细胞外单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）被高活性酶CD73水解为腺苷。因此，细胞外ATP产生的死亡信号可以被CD73转化为生存信号。
    CD73是目前唯一已知的能将细胞外一磷酸腺苷转化为腺苷的细胞外5’-核苷酸酶，其可以通过与腺苷受体的相互作用来激活PKB和ERK信号通路从而调控细胞的增殖与生存。MSC-Exo中富含了大量具有较强酶活性的CD73分子，因此可以使受损组织的ATP死亡信号转换为腺苷生存前信号，从而启动细胞增殖以进行组织再生。
    2.2 恢复生物能量稳态
    OA的发病机制与线粒体损伤和功能障碍有关。OA发生部位的软骨细胞线粒体生物产量减少，线粒体电子传输链（electron transfer chain，ETC）蛋白减少。ETC是线粒体氧化磷酸化合成ATP所必需的关键步骤，因此ETC的活性和线粒体数量的减少将导致ATP的低效生产以及能量稳态的丧失。这种能量损失会导致氧化应激增加，细胞因子诱导的软骨细胞炎症，软骨细胞基质生物合成障碍，生长因子反应性增加，软骨细胞死亡增加，软骨基质层分解代谢和钙化。
    在这种情况下，OA软骨细胞的修复能力严重受损。MSC-Exo携带大量的活性糖降解ATP产生酶，如丙酮酸激酶，以及ATP产生酶，如核苷二磷酸激酶和腺苷激酶。这些糖酵解酶和ATP产生酶促进骨关节炎软骨细胞ATP水平的升高，并补偿线粒体ATP产量的减少。因此，MSC-Exo在受损软骨的修复和再生过程中维持能量平衡。
    2.3 调节免疫活性
    研究表明，免疫系统对组织修复和再生具有重要作用。在OA 受损的软骨部位，促炎症细胞因子，包括IL-1、IL-6、IL-8和MMPs的高表达在基质层的降解和关节损伤中起作用。这些促炎细胞因子和基质金属蛋白酶由滑膜细胞以及免疫细胞产生并参与OA的发生和发展。
    OA滑膜组织中M1型巨噬细胞极化通过IL-6体外抑制MSC向软骨细胞分化。此外，有研究报道M2型巨噬细胞极化可以产生抗炎的IL-10，从而抑制有害的炎症。因此，在受损软骨或骨关节炎部位，巨噬细胞对促炎环境的动态平衡调节非常重要。在小鼠模型中，将MSC-Exo注射到免疫反应活跃小鼠的同种异体皮肤移植物中，可以诱导产生调节性T细胞，从而提高同种异体皮肤移植物的存活率。
    Zhang等在大鼠关节软骨缺损实验中发现，与磷酸盐缓冲液（PBS）对照组相比，MSC-Exo处理组的软骨和滑膜中CD86+ 细胞标示的M1型巨噬细胞减少，而由CD163+ 细胞标示的M2型巨噬细胞增加。此外，在缺氧性肺动脉高压的小鼠模型中，MSC-Exo已被证明可以抑制巨噬细胞的聚集，并诱导促炎的单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoatrractant protein-1，MCP-1），从而阻止疾病的进展。
    3. MSC-Exo在治疗TMJOA中的应用
    在使用MSC-Exo进行软骨细胞治疗的试验及临床研究中，主要包括使用生物支架以装载细胞或外泌体或用粘合剂于外泌体混合，将其递送至软骨损伤区域两种方式。在生物相容性支架中使用来自软骨细胞或成骨细胞的外泌体，可以为TMJOA组织再生提供一种新的无细胞治疗模式。然而，由于支架的技术尚不成熟，尚未在临床试验中应用，因此将继续进行支架相关技术研究。
    目前提出的治疗策略中，大多着重于利用MSC-Exo恢复关节的功能和结构。在治疗过程中，可以将含有MSC-Exo的治疗剂注射到受损软骨区域中。在最近的一项TMJOA免疫活性大鼠模型研究中，与关节腔PBS注射组比较，关节腔注射骨髓间质干细胞源性外泌体（bone mesenchymal stem cells exosome，BMSC-Exo）能够早期减轻炎症，抑制疼痛和组织变性，促进增殖和基质合成以恢复颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）软骨组织，从而介导颞下颌关节的修复和再生。
    此外，在免疫活性大鼠模型中，BMSC-Exo可以通过促进细胞增殖、迁移和基质合成、减少凋亡和调节免疫反应来修复和再生临界尺寸的骨软骨缺损。目前的研究表明，基于外泌体的无细胞疗法来治疗TMJ疼痛和变性是可行的，该方法不仅能有效诱导关节软骨和骨再生，还能缓解疼痛，从而恢复关节功能。MSC-Exo能够通过一种复杂的作用机制促进TMJOA的恢复和再生。然而，只有有限的证据证明MSC-Exo在TMJ再生中的有效性，还需要进一步的研究来验证。
    4.结语
    MSC-Exo作为一种分泌型胞外囊泡，具有良好的细胞间通讯功能，无细胞结构可显著降低免疫排斥反应，具有良好的安全性和有效性，以及高潜力的治疗扩展性，在TMJOA治疗中的应用具有巨大潜力。关节软骨受损是OA病程进展的核心，受损软骨可以通过MSC-Exo的修复和再生来实现功能恢复。进一步研究其在软骨修复再生方面的功能及作用机制可指导临床治疗TMJOA，这些小囊泡或许是未来治疗TMJOA的新方向。