介孔硅酸钙纳米材料在牙体牙髓及颅颌面修复领域的研究进展

    硅酸钙（calcium-silicate，CS）生物活性材料已在盖髓、根管充填、牙本质再矿化和骨/牙体硬组织修复等口腔医学领域有了广泛的研究。但传统的CS生物活性材料如三氧化矿物凝聚体（mineral trioxide aggregate，MTA）、iRoot、Biodentine、液态硅酸钙水泥等，粒径大多数为微米级，不宜注射，缺乏载药能力，在口腔医学领域的应用仍然具有一定的局限性。
    近年来，随着纳米技术的发展，学者们研制出介孔硅酸钙纳米材料（mesoporous calcium silicate nanoparticle，MCSN），发现其具有良好的介孔结构以及纳米粒径，显示出更优的生物活性、生物相容性、载药缓释能力，研究表明MCSN在牙体牙髓领域和颅颌面修复领域具有广阔的应用前景。本文现对MCSN的生物学性能以及在口腔领域的研究进展进行综述。
    1.MCSN的物理化学特性与制备
    MCSN主要构成元素为钙（Ca）、硅（Si）、氧（O），主要成分为CS，富含Si-OH基团。MCSN为一种球型纳米介孔晶体，粒子直径一般为100~200nm；介孔是孔径大小介于微孔（＜2nm）和大孔（＞50nm）之间的孔隙结构，MCSN的介孔结构大多是有序的，孔径范围为3.0~10.0nm。
    MCSN的纳米级粒径与介孔结构促使其比传统的CS生物活性材料具有更良好的理化特性，具有较高的比表面积（200.0~300.0m2·g-1）和良好的孔隙容积（0.2~1.0cm3·g-1），可以持续地释放出钙离子（Ca2+）以及硅离子（Si4+）；另一方面纳米级的颗粒更易与骨/牙体组织结合，更易进入根管以及牙本质小管，便于制成注射剂，方便使用；此外，MCSN有序的介孔结构还使其具有负载和释放药物的能力。
    目前，MCSN的制备方法是基于制备传统CS生物活性材料的溶胶-凝胶法，以表面活性剂为模板剂，在纳米水平上进一步控制生物活性材料的介孔形貌。合成的一般过程为：将表面活性剂、酸/碱加入到水中组成混合体系，然后向其中加入硅源与钙源，进行水热处理或室温处理后，洗涤、过滤后经煅烧或化学处理除去模板剂，形成孔隙，得到产物。2012年，Wu等提出的以十六烷基三甲基溴化铵（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）为模板，正硅酸乙酯为硅源，硝酸钙为钙源制备MCSN的方法。在随后的研究中，许多学者采用CTAB模板法均成功制备出具有良好的球形纳米结构、有序介孔通道的MCSN。总的来说，CTAB模板法简便、易行，适合广泛运用。
    2.MCSN材料的生物学性能
    2.1MCSN的生物相容性
    生物相容性是口腔材料临床运用的前提。大量研究表明：MCSN对大部分的细胞具有良好的生物相容性，例如成骨细胞、骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cell，BMSC）以及牙髓细胞等，这与其释放出的Ca2+和Si4+有关，Si4+可以促进细胞增殖黏，Ca2+有利于在材料表面形成类羟磷灰石沉积，为细胞黏附沉积提供了生物活性位点。
    有学者通过观察细胞在MCSN材料表面的黏附与增殖以检测其生物相容性，结果发现：MCSN材料可以支持成骨细胞、牙髓细胞、BMSC等在其表面黏附增殖。Huang等发现：在细胞培养初期，与CS组相比，MCSN组的细胞的黏附表现更良好，这可能是因为介孔结构为细胞提供了更多的黏附空间。MCSN释放出的Ca2+和Si4+一方面有利于细胞增殖黏附，另一方面使周围微环境呈碱性，碱性微环境有利于发挥局部抑菌作用，但高浓度的碱性微环境可能影响细胞活性，因此，MCSN的生物相容性具有一定浓度依赖性。
    学者们通过将MCSN溶于磷酸盐缓冲盐溶液或者培养基中制取MCSN浸提液，研究不同浓度MCSN对细胞活性的影响。MCSN浸提液浓度为12.5~100mg·mL-1时对牙周膜细胞无细胞毒性，甚至在浓度为100mg·mL-1时能增加牙周膜细胞活性；然而，MCSN浸提液浓度在高于40mg·mL-1时会对BMSC产生细胞毒性。
    上述结果表明：MCSN的生物相容性不仅具有浓度依赖性，还与抗菌性能和细胞种类有关，之后的研究应该结合考虑平衡所有相关因素，以在不影响生物相容性的同时，提高材料的抗菌能力。此外，目前MCSN生物相容性的研究仍停留在体外试验的细胞层面,需要更多的体内实验验证MCSN材料对器官、组织水平的影响，后续研究可以建立口腔环境模型，针对性地探究其在复杂口腔环境中的生物相容性。
    2.2MCSN的生物活性
    MCSN具有一定的仿生再矿化性能，能够诱导与骨/牙体硬组织组成相似的类羟磷灰石层形成，其置于体液/模拟体液时，材料会与宿主骨/牙体硬组织界面发生一系列的溶解沉淀反应，首先溶出释放Ca2+，与体液中的H+进行离子交换，继续吸收Ca2+和PO43-形成了无定型的钙磷沉积层；随后释放出的Si4+，为磷灰石沉积提供了稳定的微环境，最终能够在材料交界面形成类羟磷灰石层沉积，可以刺激矿化细胞的迁移。
    Huang等的体外矿化实验发现：MCSN组表面沉积的类羟磷灰石数量比CS组更多，证明了与传统CS材料相比MCSN材料具有更优的生物活性。一方面可能是因为MCSN的介孔结构使其持续地释放出Ca2+与Si4+，加速磷灰石的沉积；另一方面可能是介孔结构为矿化沉积提供了良好的生物活性位点。然而，上述关于MCSN的仿生矿化机制多是基于传统CS材料和介孔硅系材料相关研究，针对MCSN本身的再矿化机制的研究仍较缺乏，需要更多的研究来明确其引导组织再矿化的原理，以推动MCSN的仿生矿化作用向临床转化。
    MCSN还具有良好的成骨/成牙活性，材料表面形成的类羟磷灰石层为细胞提供了适宜的微环境，材料周围释放的Ca2+与Si4+有利于成骨细胞黏附、增殖以及诱导BMSC分化成为成骨细胞，还可以增强成骨相关基因的表达。Peng等证明：MCSN可以增强BMSC成骨基因碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨钙素（osteocalcin，OCN）和Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor2，Runx2）的表达；Wu等证明：MCSN可以促进牙周膜干细胞的成骨基因ALP、OCN、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达。
    有学者制备了MCSN的复合支架，构建了大鼠颅骨缺损模型、兔股骨缺损模型，结果发现：MCSN复合支架对骨缺损愈合有促进作用，具有良好的体内成骨性能。但是目前缺乏关于单纯MCSN材料的体内实验，有关MCSN的成骨/成牙活性的机制研究也处于初级阶段，仍需要进一步的探索。
    2.3MCSN的载药缓释性能
    MCSN是良好的药物和生物活性成分的载体材料，具有良好的应用前景。MCSN的载药及缓释性能与其介孔结构（孔径大小、孔隙容积、比表面积、介孔表面化学基团）密切相关。MCSN的孔径大小为3.0~10.0nm，所以可以吸附分子大小在此范围内的药物；此外，介孔表面的Si-OH基团为药物提供了吸附位点，还能与周围分子相互作用，从而释放出药物；另一方面，MCSN良好的孔隙容积为载药提供了足够的空间，较高的比表面积提高了药物的吸附效率。所以与传统的CS材料相比，MCSN具备更优异的载药缓释性能，作为新型药物释放系统有着良好的应用前景。
    目前，MCSN的药物缓释相关研究已取得一定进展，Huang等发现：载入庆大霉素后的MCSN在模拟体液下可以持续释放5d，且第5天释放的药物量为第1天的2倍，约为1.66μg·g-1，而CS组释放庆大霉素仅持续了1d左右，且5d的总释放量仅略高于第1天，为1.0933μg·g-1，MCSN组表现出更好的缓释能力；Wu等发现：氨苄西林从MCSN的释放缓慢且持久，2周累积释放30%，证明了MCSN优异的药物缓释性能。
    还有学者以生长因子为模型药物，将骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor2，FGF-2）载入MCSN材料中，体外释放实验结果表明：与CS组相比，MCSN组BMP-2与FGF-2释放的时间更长，总释放量更多，显示出更优异的缓释曲线，同样证明了MCSN优异的药物缓释能力。值得注意的是，与MCSN的药物缓释能力不同，目前仅有少数学者对MCSN本身的载药能力进行了检测。
    Wu等测得MCSN的氨苄西林的载药量为20.69mg·g-1；Kao等通过浸泡法将FGF-2载入MCSN中后发现：在浓度分别为5μg·mL-1和10μg·mL-1的FGF-2溶液中，MCSN的载药量分别为742pg·g-1与1219pg·g-1。MCSN作为一种具有广阔应用前景的载药缓释系统，之后的研究需要着重于确定MCSN各种药物的载药量以及载药效率，同时进一步验证其缓释性能，以推动其向临床应用转化。
    另外，MCSN还可以作为添加剂提高复合材料的载药缓释性能。研究表明：MCSN的掺入可以提高小麦醇溶蛋白材料的载药能力，且MCSN含量越高，小麦醇溶蛋白的姜黄素载药效率越高；同样，MCSN也可以改善二氧化碳纳米管系统的缓释性能，延长了洛索洛芬的释放时间。
    在之后的研究中，学者们应重视MCSN与其他载药材料的结合，研制出更优异的载药缓释系统。此外，最近的研究表明：可以通过功能化修饰介孔表面化学基团以进一步提高材料的缓释性能，且MCSN的载药缓释性能不仅由材料本身的介孔结构决定，还与药物本身的性质密切相关，此后的研究应考虑到上述所有因素，重视功能化修饰，以便将来研制出具有更优载药缓释效率的材料。
    2.4MCSN的抗菌性能
    目前的研究表明：MCSN对口腔常见致病菌有良好的抗菌作用。最近的研究表明：MCSN对大肠杆菌有明显的抗菌作用，还可以破坏牙本质表面的粪肠球菌生物膜；MCSN良好的抗菌性能可能是因为其纳米级粒径可以与带负电荷的细菌表面相互作用，通过内吞作用进入细菌内部，抑制细菌活性；此外，MCSN释放的离子使周围微环境呈碱性，也可以发挥局部抑菌作用。
    值得注意的是，范启航发现：MCSN浸提液对牙龈卟啉单胞菌的最小抑菌浓度与最小杀菌浓度分别为40mg·mL-1和60mg·mL-1，证明了MCSN具有良好的抗牙龈卟啉单胞菌性，但40mg·mL-1的MCSN浸提液对BMSC具有一定的细胞毒性。此外，MCSN本身的抗菌性能无法达到临床应用的要求，所以仍需要进一步研究其确切的抗菌机制，以在保证其生物相容性的基础上，增强抗菌性。随着研究的发展，学者们利用MCSN的介孔结构，将抗菌药物或抗菌金属元素载入其中，进一步提高了MCSN的抗菌性能，在载入氯己定、庆大霉素等药物和银（Argentum，Ag）、锌（Zinc，Zn）元素后，MCSN的抗菌性能得到明显的提升，甚至接近常用根管消毒剂氢氧化钙，在牙体牙髓治疗领域具有良好的应用前景。
    3.功能性金属修饰改性MCSN的生物学性能
    MCSN易于进行功能性金属修饰，一方面MCSN可以将金属离子直接吸附到介孔结构中，另一方面MCSN中的钙离子在合成时容易被其他金属离子替代。功能性金属元素修饰改性后的MCSN材料可以持续释放出相应的金属离子，发挥出其对应的作用。研究表明：抗菌元素（Ag、Zn）的加入，有效地增强了MCSN的抗菌性能。此外，生物活性元素修饰MCSN还是增强生物活性的有效方法，Yu等将锶（Strontium，Sr）掺入到MCSN复合材料中，结果发现Sr的掺入增强了材料的成骨活性；有学者将钆（Gadolinium，Gd）、镧（Lanthanun，La）掺入到MCSN复合支架中，发现修饰后的MCSN可以直接表现出Gd与La的生物活性，La可以激活转化生长因子-β信号通路，Gd可以激活Wnt/β-连环蛋白途径信号通路。
    把铕（Europium，Eu）掺入到MCSN中后，在不影响材料载药能力的基础下，Eu3+在紫外灯照射下可以发出红光，且发光强度随药物释放量的变化而变化，有利于监测药物释放。这些实验为今后研究MCSN应用于不同疾病、不同需求的口腔复合材料提供了新的方向。但是，功能性金属修饰MCSN并不是简单的加法，金属离子的掺入可能会影响MCSN本身的生物学性能。
    Leng等发现：Ag的加入增加了MCSN的细胞毒性，且Ag的掺入量越高细胞毒性越大，这与Ag本身的细胞毒性有关，需要进一步实验确定掺Ag量的生物安全范围。还有学者发现：Sr的掺入对MCSN的载药缓释性能有一定负面影响，这种影响的具体机制尚不明确。由此可见，功能性金属修饰后对MCSN生物学性能的影响存在一定的不确定性，如何在保持其优秀的生物学性能的基础上，进一步发挥功能性金属离子的作用，是之后的研究重点。
    4.MCSN材料在口腔医学领域的应用前景
    4.1MCSN在牙体牙髓领域的应用前景
    理想的牙体牙髓材料应该具有优异的生物相容性、抗菌性、可注射性、根管封闭性等特点，然而，目前临床应用的材料都具有一定的不足之处。氢氧化钙作为盖髓剂、根管消毒剂、根尖诱导剂，在牙体牙髓有着广泛的应用，但其细胞毒性较强，且溶解性和扩散性较弱，难以清除牙本质小管及变异根管内的细菌，还会增加牙本质断裂的风险；MTA等新型硅酸钙材料的性能有了一定提升，现作为盖髓剂与根管封闭剂广泛应用于临床，但其不具备载药能力，且粒径为微米级，不利于注射；纳米羟磷灰石作为一种新型纳米材料，具有优良的生物相容性以及体外矿化能力，近年来在牙体修复以及牙髓治疗方面备受关注，已有成功的临床应用先例，但缺乏抗菌能力。
    如前所述，MCSN具备良好的生物相容性、生物活性、可注射性，对牙体牙髓疾病常见致病菌如粪肠球菌、牙龈卟啉单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等都具有抗菌作用，其有望克服上述牙体牙髓材料的局限性，成为一种理想的根管充填或根尖诱导材料。有学者构建了羊根管-根尖复合体体外模型，将制备的MCSN糊剂与氢氧化钙糊剂注射于根尖根管腔内，结果发现与氢氧化钙相比，MCSN不仅根管充填性能良好，还具有良好的诱导根尖矿化的性能，且具有更良好的细胞相容性；此外，Zhu等还发现：MCSN对牙本质断裂模数与弹性模量均无负面影响，而氢氧化钙显著降低牙本质断裂模数。
    Leng等建立了体外根管粪肠球菌感染模型，结果发现：与传统的根管充填剂MTA相比，MCSN可以浸润到牙本质小管中，有效抑制根管壁内的粪肠球菌与牙本质表面粪肠球菌的生物膜。最近的研究还表明：与纳米羟磷灰石相比，MCSN具有更强的抗菌能力、更优的体外矿化能力。此外，MCSN还可以通过负载生物活性因子与药物，进一步提高生物学性能。
    有学者将BMP-2载入到MCSN中，促进了人牙髓细胞的牙源性分化相关基因的表达，有效增强了材料的生物活性；还有学者将药物与抗菌元素载入到MCSN，有针对性地增强MCSN对口腔致病菌的抗菌性能，有效地增强了MCSN的抗菌性能，为根管消毒提供了新的思路。尽管目前MCSN的相关研究主要集中在牙髓疾病的防治上，但其在牙体硬组织疾病领域的应用也具有较大的潜力。
    如前所述，MCSN具有独特的纳米级粒径，可以浸润到牙本质小管中，且具有一定仿生矿化能力，可以促进牙体再矿化，在治疗牙本质敏感方面具有良好的应用前景；另一方面，MCSN释放出的离子可以使周围微环境呈碱性，在抑菌的同时可以减少牙体硬组织脱矿，有望应用于龋病的防治。
    总的来说，MCSN具备较好的再矿化性、抗菌活性、可注射性和生物相容性，在促进牙体硬组织再矿化以及根管充填、根管消毒等牙体牙髓领域有着广泛的应用潜能，但是MCSN在牙体修复方面的应用仍处于假设阶段，需要进一步实验来验证。此外，目前MCSN的实验多为体外实验，需要开展更多的体内实验甚至临床试验，以确定其在复杂的口腔环境中的性能。
    4.2MCSN在颅颌面修复领域的应用前景
    在颅颌面修复领域，骨缺损修复材料应该具有良好的生物相容性、骨诱导性、骨传导性以及成骨性。目前，骨组织工程支架材料众多，如β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）、半水硫酸钙（calcium sulfate hemihydrate，CSH）、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）和壳聚糖（chitosan，CTS）等，然而其均具有一定的局限性，目前无法找到一种材料能够符合所有要求。MCSN兼具良好的生物相容性、骨诱导性和骨传导性，同时还具有一定的抗菌和炎症调控作用，但单纯的MCSN支架机械强度不足，降解速率不足，抗弯曲、抗破坏性能较弱，所以，目前的研究方向集中在将MCSN与其他骨组织工程支架材料相结合，以提高复合支架材料的性能，在颅颌面修复领域极具潜力。
    研究表明：MCSN与CSH、PCL和CTS等材料形成的复合支架，克服了MCSN力学性能的缺点，保留了MCSN良好的生物活性和生物相容性，提高了复合支架的成骨性能。体外研究表明：MCSN复合支架可以支持骨相关细胞的黏附增殖，刺激成骨相关基因的表达，诱导类羟磷灰石沉积，还可以促进血管形成，这说明MCSN复合支架在骨组织再生方面具有良好的应用前景。
    此外，随着3D打印技术在骨组织工程领域的广泛应用，有学者使用该技术成功制备了有序多孔的MCSN复合支架，通过3D打印制备的MCSN/PCL复合支架具有良好的力学性能、降解性能和生物学性能，可以支持BMSC、牙髓干细胞的黏附增殖；在兔股骨缺损实验中，显微CT（microcomputed tomography，Mciro-CT）和组织学结果都表明MCSN/PCL复合支架可以促进骨缺损区域骨形成和血管生成，加速骨愈合。值得注意的是，MCSN可以通过添加生物活性元素，进一步增强复合支架的生物活性，不同成分的MCSN复合支架可以在液体环境中缓慢释放La、Gd、Sr等离子，为骨形成提供了有利的微环境。
    有学者通过12周的大鼠颅骨缺损模型实验，发现掺入了La、Gd的MCSN复合支架与单纯的MCSN复合支架相比，显著增加了缺损区域的新骨形成；另一方面，有学者利用MCSN的载药能力，将FGF-2、BMP-2载入到MCSN复合支架中，结果发现：生物活性因子的载入显著提高了复合支架的体外成骨能力。此外，除了可以载入生物活性因子，MCSN还可以载入抗菌药物，且其本身也具有一定的抗菌性能，之后的研究可以研制MCSN相关的抗菌复合骨支架材料，以应用于牙周炎、种植体周围炎、骨髓炎等导致的骨缺损修复中。
    3D打印技术的应用与生物活性元素的添加为之后骨组织工程支架材料的研究提供了新的思路，进一步利用MCSN的载药缓释能力也是之后的研究方向。然而，目前MCSN复合支架在颅颌面修复的研究仍处于初步阶段，缺乏对颌骨环境的分析，其在大段承重骨缺损以及感染的骨缺损区的修复效果还需要更多的体内实验与临床试验。
    5.总结与展望
    MCSN材料的生物相容性、生物活性、载药缓释性能与抗菌性能等方面已得到了证实，在牙体牙髓领域与颅颌面领域具有良好的应用前景，但目前MCSN相关的研究仍具有一定的局限性：1）目前，MCSN的合成方法较单一，CTAB模板法仅适用于初步研究，若要应用于临床，还需要找到操作更加简便的合成方法；2）MCSN本身的生物学性能、生物活性以及力学相关性能无法完全满足临床需求，尽管可以通过载药、功能性金属修饰以及与其他材料复合来提高其性能，但MCSN的抗菌机制和载药缓释等机制尚未明确，还需要更多的研究来精确地平衡这些因素，以合成优异性能的MCSN复合材料；3）口腔环境以及颌骨环境十分复杂，而目前MCSN相关的动物实验和临床试验仍较匮乏，其在牙体牙髓领域和颅颌面修复领域的应用研究处于初步阶段，甚至是假设阶段，需要进一步的研究来验证。
    之后的研究应集中在克服上述局限性，目前的研究已经提供了一些新思路，比如构建与人体口腔、颌骨环境相似的实验模型，功能化修饰介孔表面化学基团，利用3D打印技术将MCSN与有机骨支架材料复合等。相信随着对MCSN研究的不断深入，一定会研制出理化性质与生物学性能更符合口腔临床要求的材料，有望在牙体牙髓领域与颅颌面修复领域发挥重要的作用。