外泌体在骨髓间充质干细胞骨向分化及其在牙周再生中的研究进展

    牙周病是人类口腔第一高发疾病，在长期持续的炎症刺激下，牙槽骨可发生病理性吸收，最终导致牙齿松动甚至脱落。随着组织工程研究的逐渐深入，干细胞在骨组织修复中的作用日益凸显，但体外扩增能力有限、生物学效应繁杂、主要生物功能可被生物活性分子组合所取代等局限性阻碍了其发展和应用。
    近期研究发现，外泌体（exosome）能够通过携带蛋白、miRNAs等分子传递信号，调控骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）等成骨相关细胞的增殖、分化，影响骨组织生成和吸收过程。本文就外泌体在BMSCs骨向分化中的研究作一综述，为外泌体在临床骨缺损中的应用提供依据。
    1.外泌体的生物学特征
    外泌体是一种来源于多种细胞的细胞外囊泡，不同细胞衍生的外泌体可通过核酸、蛋白质和脂质等生物分子传递信号，介导细胞间的信息交流，促进血管生成和调控免疫炎症反应。外泌体存在于生物体的各种体液中，可通过循环系统在全身传播，并通过血脑屏障和其他组织被靶细胞吸收。
    外泌体可通过3种方式传递信号：受体－配体结合、膜融合或吞噬作用。目前多种类型细胞已被证实能产生并分泌外泌体到细胞外环境中，通过细胞间的相互作用影响局部微环境并调节细胞的生理功能。外泌体特性与其来源的细胞有关，不同细胞来源的外泌体通过不同的分子传递信号，调控目标细胞的发育、增殖及免疫能力。
    2.不同来源外泌体在BMSCs骨向分化中的作用
    2.1调节性T细胞（Treg）外泌体在BMSCs骨向分化中的作用
    Treg细胞是T细胞中一类具有免疫抑制功能的T细胞亚群，能够维持体内免疫系统的稳定性并调控炎症反应，是重要的免疫调节功能细胞。Treg细胞在2013年才首次被证实具有释放外泌体参与免疫调节的作用，外泌体是Treg细胞发挥生物功能不可或缺的组成部分，CD8+Treg细胞活化后释放外泌体表达抗炎介质抑制树突状细胞引发的免疫反应，以及表达FasL发挥细胞凋亡作用，抑制机体免疫反应。
    Tregs介导的抗炎微环境能促进骨再生，通过抑制IFN-γ和TNF-α的分泌，提高BMSCs介导的骨形成。另一项研究证明，Treg细胞来源的外泌体过表达miR-142-3p，显著促进BMSCs成骨分化和血管生成。miR-142-3p还可通过抑制TGFBR1/SMAD2促进成骨分化。
    2.2巨噬细胞外泌体在BMSCs骨向分化中的作用
    巨噬细胞在先天免疫反应和成骨功能中发挥着关键作用。在急性炎症时，巨噬细胞可将炎症细胞聚集到受损部位后清除损伤组织，同时释放抗炎信号介导骨再生。巨噬细胞有M1型（促炎表型）和M2型（抗炎表型）。急性炎症期，M1型巨噬细胞表达活跃，随后巨噬细胞可分化为M2型巨噬细胞，并释放相关因子促进成骨，如骨形态发生蛋白2等。
    研究表明，用钛颗粒刺激巨噬细胞，TNF-α等促炎因子表达明显上调，流式细胞术检查钛颗粒刺激的正常和转染巨噬细胞，均观察到巨噬细胞向M1型极化。研究发现miR-5106在M2型巨噬细胞来源的外泌体（M2D-Exos）中显著过表达，而在M1型巨噬细胞来源的外泌体（M1D-Exos）中表达下降。这种外泌体miRNA可以直接靶向盐诱导激酶2和3（SIK2和SIK3）诱导BMSCs成骨分化。
    SIK2/SIK3过表达时，可在BMSCs中检测到成骨基因水平降低。miR-5106过表达导致SIK2和SIK3的表达明显受到抑制，可挽救SIK2/SIK3对成骨分化造成的部分负面影响。另一项研究报告称，高糖高胰岛素对BMSCs成骨分化潜能有抑制作用。干预M2型巨噬细胞来源的外泌体后，BMSCs中的Hedgehog信号通路被激活，成骨分化潜能增强。
    2.3BMSCs外泌体在BMSCs骨向分化中的作用
    BMSCs外泌体含有三种成骨相关miRNA：miR-196a、miR-27a和miR-206，其中miR-196a是最重要的外源性成骨调节因子。此外，血管再生在骨修复中的也起着至关重要的作用。BMSCs衍生的外泌体能够增加体外内皮细胞的活力，并刺激体内血管生成。BMSCs衍生的外泌体过表达miR-26a-5p，可在体外延缓滑膜成纤维细胞的损伤，并在体内减轻骨关节炎损伤。
    研究发现，BMSCs衍生的外泌体过表达糖蛋白非黑色素瘤克隆B（GPNMB）能有效促进大鼠BMSCs的增殖和成骨分化，减轻卵巢切除诱导的骨丢失，可能的机制是激活Wnt/β-catenin信号通路。另一项研究报告称，将BMSCs衍生的外泌体可逆地固定在三维多孔聚醚醚酮（PEEK）表面上，结果显示在Exo-TA-SPEEK上培养的BMSCs表现出更好的增殖和黏附能力。负载外泌体的聚醚醚酮可通过NF-κB途径调节巨噬细胞极化，Exo-TA-SPEEK提供了更有利的骨免疫微环境，有利于BMSCs的进一步成骨分化。此外，研究结果表明Exo涂层的PEEK可促进BMSCs的直接成骨分化。
    2.4成骨细胞外泌体在BMSCs骨向分化中的作用
    成骨细胞来源外泌体内蛋白质和RNA可发出信号，触发靶细胞应答，促进细胞间信息交流。研究表明成骨细胞在分化中晚期释放的外泌体可显著促进去卵巢小鼠BMSCs成骨分化，改善骨质疏松;结果还表明，外泌体对成骨的影响与基质囊泡的成熟有关，只有中晚期的外泌体具有成骨诱导作用，中期的外泌体经人工软骨淋巴处理可促进基质囊泡的成熟，但对成骨诱导作用无影响。此外，来自矿化成骨细胞的外泌体可促进BMSCs分化为成骨细胞。
    矿化成骨细胞来源的外泌体可激活Wnt信号促进BMSCs的骨向分化。在受体细胞中，通过激活下游信号通路，尤其是Wnt信号、胰岛素信号、TGF信号和钙信号参与成骨。但成骨细胞来源的外泌体也可导致骨丢失，通过RANKL促进破骨细胞的形成。此外，miR-214可抑制PTEN表达，同时激活PI3K/Akt信号通路来促进破骨细胞的形成。
    2.5破骨细胞外泌体在BMSCs骨向分化中的作用
    除骨吸收外，破骨细胞也能够促进血管生成、调节成骨细胞的活性。破骨细胞来源的外泌体还可通过miR-324靶向arhgap1（骨分化的负调控因子），在体外可显著诱导BMSCs的成骨分化和矿化，且富含miR-324的外泌体修饰支架在小鼠颅骨缺损模型中表现出较高的成骨能力。
    有学者发现核因子受体激活剂RANK在破骨细胞释放的外泌体中高度表达，是破骨细胞发生旁分泌的调节因子，RANK负载的破骨细胞衍生囊泡结合成骨细胞RANKL，并通过RANKL反向信号促进骨形成。此外，来自成熟破骨细胞的外泌体可以通过旁分泌机制抑制破骨细胞的形成。
    破骨细胞衍生的外泌体在炎症性骨病中可防止过度骨溶解。类风湿性关节炎患者血浆中的外泌体与正常人血浆中的外泌体相似，能够抑制破骨细胞的产生，可能是由于成熟破骨细胞衍生的外泌体中受体RANK可作为诱饵受体，竞争性结合RANKL，与骨保护素作用类似。
    2.6脂肪干细胞外泌体在BMSCs骨向分化中的作用
    脂肪干细胞（adipose stem cells，ASCs）方便且易于获取，近来逐渐进入人们视野。研究表明ASCs表现出与BMSCs类似的生物学能力。ASCs衍生的外泌体可通过抑制促炎介质TNF-α、IL-6、PGE2、NO的产生和增加抗炎因子的表达水平，促进间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的骨形成。研究发现，ASCs来源的外泌体可通过过表达miR-375，上调具有成骨诱导的成骨相关基因（包括RUNX2、ALP、COL1A1和OCN）的mRNA表达，促进BMSCs体外成骨分化。
    另一项研究表明，将ASCs衍生的外泌体固定在聚多巴胺涂层的聚乳酸-co-乙醇酸（PLGA/pDA）支架上，外泌体可从PLGA/pDA支架中缓慢且持续地释放出来，增强BMSCs的体外迁移能力。此外，负载ASCs外泌体的Mg-GA支架，可稳定骨移植环境，保证血液供应，促进BMSCs成骨分化。
    3.外泌体在牙周炎中的作用
    牙周病导致的牙周组织破坏与致病菌引起的免疫炎症反应有关，牙周炎中的多种炎症因子可导致进行性骨溶解，抑制骨形成。在炎症过程中，各种细胞释放的外泌体可同时抑制炎症反应，这可能是机体的自我保护作用。然而，这种抗炎作用并不能完全阻止牙周炎的进展。即使清除牙周病原体，牙周炎所导致的牙槽骨吸收也难以恢复，改善牙周附着水平是一个重要的治疗目标。
    近年来，外泌体在牙周再生中的应用潜力已得到证实。外泌体在牙周炎的治疗中有3个主要途径：调节免疫反应、抑制骨吸收和启动骨修复。研究表明BMSCs能够促进牙周再生，BMSCs来源外泌体可通过增加牙周膜（PDL）细胞的迁移和增殖来促进牙周再生，是一种可行的治疗牙周组织缺损方法。研究证实BMSCs外泌体可通过腺苷受体介导的AKT和ERK信号通路激活增强PDL细胞迁移和增殖，其与胶原海绵联合使用能够在大鼠牙周组织缺损模型中促进牙周组织再生，且不会引起任何不良反应。
    另一项研究发现ASCs来源的外泌体对牙周炎的治疗效果优于ASCs本身。ASCs来源的外泌体可促进牙周组织的再生，为牙周治疗提供新的参考。此外，牙龈间充质干细胞（GMSC）衍生的外泌体可促进M1型巨噬细胞向M2型极化，抑制炎症反应，可能为巨噬细胞参与牙周炎治疗提供了一种可能方法。
    4.总结
    外泌体在治疗骨缺损方面具有巨大的应用潜力，局部微环境中的Treg细胞、BMSCs、成骨细胞和巨噬细胞等不同来源的外泌体均可参与调节骨修复。与临床使用的常规疗法相比，外泌体具有良好的稳定性、可操作性和广泛的来源，因此应用前景十分广阔。然而，其系统机制尚未被有效解释，不同剂量的外泌体对骨再生修复可产生不同的影响，相关研究有待进一步深入。由于体内和体外以及生物体之间的差异，外泌体在牙周炎中的作用也需进一步的研究来确认其疗效。不同细胞衍生的外泌体可通过各种途径和信号调节炎症反应，促进BMSCs成骨分化和牙周组织再生，为牙周炎导致骨缺损的治疗提供参考。