浓缩生长因子应用于牙髓修复与再生的研究进展

    牙髓是由细胞、神经、血管和纤维等组成的非矿化组织，为一个复杂的3D空间结构。牙髓组织作为牙齿重要的组成部分，在维持牙齿功能的运转和稳定中起着至关重要的作用，其中包括氧气和营养物质新陈代谢、形成牙本质、维持牙髓-牙本质复合体的活力等。
    牙髓易受到微生物、炎症、外伤等刺激致其变性甚至坏死，通过适当的处理，可使受损牙髓组织的部分或全部生物结构和功能得到修复或再生。近年来，随着组织工程医学的发展，引导组织再生术、牙髓修复与再生技术逐渐应用于临床中，参与牙髓组织修复与再生，主要包括干细胞、细胞支架及各种生长因子。在过去数十年，自体血源性血小板浓缩物已经发展成为再生医学的生物材料，广泛应用于各种治疗技术，特别是涉及骨组织工程、口腔组织再生以及美容整形外科等。
    制备血小板浓缩物的工艺是目前的研究热点。基于制备方案的不同，这些血小板浓缩物主要以富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）、富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）和浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF）为代表。PRP为第一代血小板浓缩物，于20世纪70年代提出，其制备过程复杂、成本高，需加入抗凝剂及激活剂，可能引起免疫排斥反应及过敏反应。
    Choukroun等对PRP改良后，制备出第二代血小板浓缩物——PRF，相较于PRP，PRF提取方法简单，无需添加任何试剂，具有良好的生物安全性及经济性。2006年，Sacco首次报道CGF，为最新一代血小板浓缩物，也被命名为PRF衍生物或Sacco的PRF。CGF制作方法与PRF相似，但其具有更厚、排列更有规律的纤维蛋白，网络结构更加致密，生长因子含量更加丰富，其释放生长因子的过程更接近组织愈合自然过程，生物学性状明显优于PRF。
    目前CGF在牙髓修复与再生的临床应用研究较少，为了使CGF能在临床应用中获得更广泛的认知及使用，本文就CGF生物学特点及其在牙髓组织修复与再生领域的应用做一综述。
    1.CGF的结构及其生物学特点
    将所采集的患者静脉血按照特定的离心方案进行离心后，血液分为3层：顶层为血小板血浆，中间层为CGF凝胶，底层为红细胞。CGF为表面光滑、半透明凝胶状、质软富有弹性的物质。与PRF比较，CGF的密度更高，表面更光滑，界限更清晰。CGF由3个部分组成：顶部为白色部分，下部为红色部分，中间为白膜层。
    综合众多学者的研究，CGF纤维蛋白含有高浓度、多种类的生长因子，主要包括：血管内皮生长因子、类胰岛素生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-β、成纤维细胞生长因子以及表皮生长因子等。血管内皮生长因子可刺激血管内皮细胞的迁移和增殖，并且在诱导血管生成和调节血管通透性方面发挥重要作用，从而实现早期创面修复。类胰岛素生长因子促进人骨髓间充质干细胞增殖、分化，有利于软骨形成。
    血小板衍生生长因子可促进多种细胞的有丝分裂、分化、趋化和血管生成，促进创口愈合，刺激胶原蛋白的分泌。转化生长因子-β可促进间充质干细胞和上皮细胞的增殖和分化；转化生长因子-β1能增强血小板衍生生长因子-BB、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的有丝分裂，具有一定的协同作用。
    综上所述，CGF可能通过多种生长因子发挥促进组织修复的综合作用。CGF还包含CD34+免疫细胞、内皮细胞、白细胞和成纤维细胞，用以血管生成和组织重塑，并为细胞迁移提供基础，还具备一定的抗炎和免疫调节作用。
    2.CGF在牙髓修复与再生中的应用
    2.1CGF在牙髓修复中的应用
    由于外伤或临床治疗中备洞导致的机械性针尖大小的露髓，通过使用药物或生物材料直接盖髓以保存牙髓是常规的治疗方法。氢氧化钙和矿物三氧化物凝聚体作为盖髓剂，在临床应用中存在使牙髓腔闭塞、牙齿变色和牙髓变性等诸多缺点。Tian等研究证实CGF可用于直接盖髓治疗，CGF在直接盖髓过程中作用于牙髓细胞（dental pulp cells，DPCs）。DPCs作为口腔源性干细胞之一，具有一定的抗炎作用，可形成支架，并能够起到免疫调节作用。
    CGF可促进DPCs的增殖和矿化，有助于促进牙髓组织恢复；CGF又可在直接盖髓中维持牙髓活力。CGF用于盖髓能有效地维持牙髓的组织结构及生理功能，相较于氢氧化钙和矿物三氧化物凝聚体直接盖髓后的牙髓组织更接近于生理状态。但CGF作为具有研究前景的盖髓剂，应用于临床前还需进一步观察及研究。了解其作用机制将对牙髓损伤的新治疗手段具有重要意义。
    2.2CGF在牙髓再生中的应用
    牙髓再生也称再生性牙髓治疗，是通过组织生物工程技术，引导牙本质牙髓复合体、牙根组织的再生修复，即去除病变或坏死的牙髓组织，用健康的牙髓组织代替，使牙齿恢复活力，包括感应外源性刺激、激活防御反应、形成修复性牙本质等功能，从而保持牙根连同周围组织的健康状态。
    牙髓再生依赖于具有增殖和多向分化潜能的干细胞、调节细胞命运的生长因子以及提供良好微环境的支架。目前已发现参与牙髓再生的干细胞主要有骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、根尖牙乳头干细胞（stem cells of apical papilla，SCAPs）、牙周膜干细胞等，这些干细胞主要源自于根尖区周围组织。在炎症早期，DPSCs表现活跃，维持牙髓组织的基本功能。牙本质内侧硬组织形成的质量、性质取决于SCAPs，且DPSCs和SCAPs均具有高增殖性、高分化能力等特点，是牙髓再生的最佳细胞来源。
    研究表明，SCAPs是发育原发性牙本质及牙髓牙本质复合体的天然来源，具有引导牙髓再生的能力，并在调节未成熟牙齿发育方面起到关键作用，且在炎症条件下仍能保持其活力和特性，并增加了成骨和血管生成潜力。再生性牙髓治疗成功的关键在于刺破根尖出血后，根管内是否能形成高质量血凝块。血凝块作为再生根管治疗的生物支架，且含有各种干细胞，影响治疗牙的预后。若高质量的血凝块不能在根管空腔内形成，可能会降低牙髓血运再生的成功率。近年来，血小板浓缩物已被用作支架材料，以弥补高质量血凝块的缺乏，且其富含各种生长因子，可提高在牙髓再生中应用的成功率。
    2.2.1CGF用于牙髓再生的体外实验研究
    大部分体外实验集中于CGF对体外细胞的增殖、迁移和成骨分化的作用研究。Jin等研究发现，CGF支架为富含血小板和白细胞的多孔纤维蛋白网络结构，与DPSCs具有良好的生物相容性。CGF可促进人DPSCs增殖、迁移及成骨分化，促进牙本质和血管生成，可作为一种承载生长因子的支架来促进牙髓修复与再生。
    研究发现，CGF对人DPSCs和内皮细胞具有促血管生成作用，在牙髓血管再生方面具有良好的应用潜力。CGF同样具有显著促进SCAPs增殖、迁移和分化的能力；有学者发现异体CGF亦可明显促进SCAPs增殖、迁移能力及成骨/成牙向分化能力，提示异体CGF在牙髓损伤修复及组织工程应用中具有重要的潜在作用，为异体CGF在口腔组织工程的临床研究提供理论基础。
    2.2.2CGF用于牙髓再生的临床研究
    在再生性牙髓治疗中，当血凝块形成不够时，CGF可充当根管内支架替代血凝块介导牙髓再生，并取得较佳的临床效果。同样，将CGF应用于存在根尖周病变的年轻恒牙再生性牙髓治疗中，可见患牙根尖周病变痊愈、根尖孔发育完善、牙根增长，患牙保留成功。
    3.总结及展望
    组织工程用于牙髓再生基于3个重要因素：干细胞、细胞支架及多种生长因子。组织的修复和再生是一个连续而精密复杂的过程，需要多个调控基因、多个细胞、多种生长因子通过多条信号通路在不同阶段发挥各种作用，单一的生长因子效果往往欠佳。而CGF富含多种生长因子，为促进牙髓组织的修复和再生提供了新的思路。
    CGF的制备方法简便，完全取自自体血液，具有良好的生物相容性；其应用方式灵活，可制备成CGF膜、CGF凝胶和CGF条件培养基等。但对CGF不同形态的制作及保存目前尚无统一标准，这是CGF应用的局限性之一。CGF在体内应用后，在12d时基本降解，其所构建的局部缓释系统最长持续释放时间仅28d，可适用于口腔的软组织再生，但对于骨组织的再生是不够的，这也是CGF的不足之一。因此，CGF内的生长因子缓释系统还需更深入的研究。
    综上所述，CGF具有良好的生物相容性，在促进牙髓组织修复与再生方面取得了较为满意的效果，同时制作方法简单，显示出较好的应用推广前景。但是，CGF应用于牙髓组织修复与再生的组织学及其临床应用机制尚不明确，需深入研究，为其在牙髓再生或其他领域的应用及推广奠定基础。同样，CGF也具有一定的局限性，对其制作保存方式、应用浓度、局部缓释时间等方面尚有待于进一步研究完善，使其在临床的应用越来越广泛，越来越方便。