姜黄素单独及联合防治口腔鳞癌机制的研究进展

    口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是十分常见的口腔上皮来源恶性肿瘤，在所有口腔恶性肿瘤中，有高达超过90%的发病率，此外，口腔处在人体颌面部与头颈部特殊交界位置，与邻近重要组织器官息息相关，血供、淋巴回流极其丰富，早期颈淋巴结转移率和复发率居高不下，患者预后较差。
    目前临床上，OSCC患者的常规治疗是根据肿瘤分期决定手术治疗是否与放化疗相结合。OSCC患者的5年总生存率大概仅有60%，局部区域复发和远处转移仍然是主要致命因素。天然药物以其多个成分及多个靶点的独特优势，在恶性肿瘤治疗和预防中发挥重要作用。研究显示，姜黄素在抗炎、抗凝、抗癌及抗氧化方面具有不可替代的功效，因其自身具有毒副作用小，多重调节通路等特点，被誉为是第3代抗癌药物。
    姜黄素（curcumin，Cur）是从姜科植物根茎中提取的天然具有二酮结构的活性成分，姜黄素常用于食品生产，价格低廉、低毒无害、来源广泛。与此同时具有抗菌、抗炎、抗癌等药理特性，引起了医学研究者的重视。
    1.姜黄素的理化性质及提取方法
    姜黄素的分子式为C21H20O6，常温下为橙黄色结晶性粉末，碱使其呈棕红色，熔点为183.0℃，易溶于乙醇等有机溶剂，不溶于水。天然姜黄素大多取自植物根茎，提取的方法有很多，例如，乙醇萃取、闪式提取、浸渍、脉冲超声辅助、酶辅助、反向高效液相色谱、微波辅助、高效液相色谱和亚临界水萃取。
    2.姜黄素抗OSCC的相关分子机制
    姜黄素抗口腔鳞癌的分子机制是通过调控各种细胞因子、癌基因与抑癌基因、蛋白激酶、活性蛋白等来实现的，分为以下几类进行介绍。
    2.1调控Caspase家族
    细胞凋亡是机体通过调控基因、传递信号实现细胞程序性死亡的正常生理活动，当机体组织细胞增殖和凋亡的平衡被打破，细胞不再按照程序进行自然死亡，就有极大可能导致恶性肿瘤的发生。细胞凋亡的实现依靠的是凋亡酶Caspase的活化，Caspase是一类半胱氨酸蛋白酶家族，介导细胞的凋亡，其存在于细胞质中，Caspase家族成员都富含半胱氨酸，会在被激活后切割靶蛋白的特异天冬氨酸残基。其中一类是起始就被切割激活，称之为启动酶；另一类被启动酶切割从而激活，称之为效应酶。
    外源性细胞凋亡与内源性途径的区别在于唤醒凋亡酶的方式，前者通过接收胞外信号刺激，后者通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活。Wilken等研究显示，姜黄素介导外源性的细胞凋亡，是通过上调Fas、Fas相关死亡结构域蛋白（Fas-associated protein with death domain，FADD）、Caspase-8和Caspase-3的表达实现。Caspase-8作为启动酶，率先被激活，Caspase-3位于细胞凋亡反应的下游，在正常情况下无活性，被切割从而激活后才会发挥促进凋亡的作用，活化后的Caspase-3与特定的凋亡底物结合，诱导细胞凋亡。
    Chang等研究发现，姜黄素纳米颗粒可诱导靶细胞，使其线粒体膜的通透性改变，跨膜电位丢失，释放凋亡相关因子，线粒体细胞色素C（cytochromeC，CytC）与凋亡酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）和Caspase-9组成凋亡小体，活化Caspase-9，从而激活Caspase-3，启动一系列连锁反应。在内源性细胞凋亡途径中，Caspase-3在反应的下游，起到效应酶的作用。
    姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡能力突出，由一系列错综复杂的生物学反应组成，根据调控路径的不同，表现形式不尽相同，有交叉、有重叠。Hu等研究显示，姜黄素并非只能调控单一路径的细胞凋亡，可以通过激活Caspase-8和Caspase-9，做到同时激活内源性及外源性细胞凋亡。
    2.2调控Wnt/β-连环蛋白通路和Notch通路
    Wnt/β-连环蛋白信号通路，参与多种肿瘤发生发展。β-连环蛋白，作为重要组分，起到调节细胞黏附作用，在OSCC中具有区别于正常细胞的定位点，其表达水平与口腔鳞癌的分化水平有关。此外，因和Notch等有着相似调控方向，调控路径也密切交联。研究发现，高浓度姜黄素作用于OSCC，通过上调活化Notch1信号，显著抑制β-连环蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。有学者研究发现，头颈部鳞状细胞癌中Wnt通路的激活增加了肿瘤干细胞的成球能力和侵袭性。
    2.3调控EGFR通路
    表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是上皮生长因子（EGF）的受体，在OSCC中通常表现为过表达。实验结果显示，姜黄素对口腔鳞癌SCC-25细胞总EGFR表达无影响，但可以剂量依赖性抑制口腔鳞癌SCC-25细胞EGFR分子磷酸化，通过抑制其活化，抑制EGFR信号通路下游转录因子蛋白激酶B、细胞外调节蛋白激酶和活化因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化，从而实现抑制OSCC细胞的增殖和侵袭。
    2.4抑制基质金属蛋白酶表达
    口腔鳞癌极易发生早期转移，是导致治疗失败的重要因素。细胞外基质从原发灶位置脱离，侵入淋巴管及血管，到达全身相应的靶向器官和组织。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等可以降解富含蛋白质的细胞外基质，是OSCC转移和侵袭的第一道防线。
    肿瘤细胞侵袭和转移重要的一环是溶解、穿过基底膜。MMP-2和MMP-9以酶原的形式分泌到细胞外，被激活后形成Ⅳ型胶原酶，通过降解、破坏基底膜的主要纤维成分——Ⅳ型胶原，向周围组织浸润。此外，还可以通过促进肿瘤新生血管的形成，加速肿瘤的侵袭和转移。Siddappa等研究表明，姜黄素可以抑制MMP-2和MMP-9的表达来抑制侵袭性。
    2.5调控p53基因的表达
    p53基因是一种抑癌基因，参与细胞周期的调控、细胞凋亡等，p53基因发生突变可导致机体肿瘤的发生。多项研究表明，在早期OSCC中p53基因经常发生表达异常，p53mRNA表达率超过75%。另有研究显示，OSCC患者p53基因突变率与年龄没有关联，60～70岁组的p53表达水平明显降低，可能是p53转基因治疗的敏感人群，这提示应该将这个年龄段的患者p53表达水平重视起来。
    上皮间充质化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞通过一定程序，获得间质细胞特定运动能力的过程。上皮来源的恶性肿瘤细胞由此获得迁移和侵袭能力。研究显示，姜黄素能够通过减少p53的表达来抑制twist和snail转录因子的表达，从而阻止OSCC细胞中的上皮-间充质转化过程。
    研究表明，姜黄素可以诱导OSCC细胞株HN4的凋亡，抑制生长。姜黄素对OSCC细胞周期的调控，表现为剂量依赖性不一致的阻滞作用。机制可能与调控上皮标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）和p53蛋白的表达相关。
    2.6调控Rho/ROCK信号通路
    细胞骨架，顾名思义参与维持细胞的基本形态，如果发生异常或者改变，对肿瘤细胞的黏附、侵袭具有重要影响。研究发现，姜黄素可以通过抑制Rho/ROCK信号通路中ROCK2的磷酸化及活化引起OSCC细胞骨架的变化，且浓度越高，引起的变化越多。Rho/ROCK信号通路与实体肿瘤侵袭和转移关系密切。
    研究显示，在OSCC细胞中，ROCK2的位置聚集区别于正常细胞，位于细胞边缘，分布与侵袭性伪足吻合。ROCK2是Rho下游的靶效应分子，可以诱导细胞进行阿米巴样运动，在沉默ROCK2基因后，MMP-2和MMP-13活性显著降低，此外，肿瘤细胞侵袭性也显著降低。
    2.7调控转录因子NF-κB的表达
    核因子-κB（NF-κB）广泛存在于各种动物细胞中，参与细胞受到外界刺激的应答，参与诱导和调节相关基因、细胞因子等的转录，例如周期蛋白D1、周期蛋白依赖激酶Cdk2等。D型细胞周期蛋白（Cyclin）中的CyclinD1是一个由人类CCND1基因所编码的蛋白质，在调控细胞G1期、细胞增殖及分裂过程中起到核心作用，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。
    一项研究结果表明，姜黄素具有显著抑制NF-κB活化的作用，其机制是通过减少OSCC中CyclinD1的表达，阻止癌细胞由DNA合成前期向DNA合成期转化，从而抑制OSCC细胞生长增殖，其抑制作用与姜黄素浓度呈正相关。OSCC晚期患者常规应用放化疗及靶向治疗，但药物耐药导致的肿瘤治疗抵抗已成为临床治疗中不可避免的问题。研究发现，中药成分可以发挥提高抗癌药物敏感性和缓解肿瘤耐药的作用。
    姜黄素和番茄红素协作可通过抑制NF-κB的活化来降低OSCC患者对放疗的抵抗。此外，姜黄素也是抑癌基因HPV16/E6的抑制剂，伴HPV感染的OSCC患者选用姜黄素治疗效果明显提升。
    另有研究发现，姜黄素可以通过改变和调节OSCC细胞周期、抑制DNA损伤修复从而起到放疗增敏作用。此外，还可以清除健康组织中高剂量X射线辐射诱导产生的活性氧，充当放疗保护剂，增强放射对OSCC的作用力，减轻多次放射治疗所带来的副作用。
    3.联合其他中药抗OSCC的机制
    3.1姜黄素联合紫杉醇
    紫杉醇是一种抗恶性肿瘤的天然珍稀药物，在抑制肿瘤增殖和促进肿瘤细胞凋亡等方面发挥重要作用。研究显示，姜黄素和紫杉醇都可以抑制口腔鳞癌CAL27细胞增殖，抑制作用具有一定的剂量依赖和时间依赖性。姜黄素或紫杉醇是通过调控Bcl-2蛋白家族的相应蛋白表达，下调Bcl-2蛋白的表达，上调Bax蛋白及活性Caspase-3蛋白的表达，从而实现抑制OSCC肿瘤增殖和促进肿瘤细胞凋亡。联合用药作用更加显著，并可以降低蛋白Bcl-2/Bax的比率。
    3.2姜黄素联合乳香酸
    OSCC具有多种发病因素，长期慢性炎症刺激与癌前病变叠加无疑推进癌症的发生进程，例如发生口腔白斑病变的同时感染念珠菌、口腔扁平苔藓多次破溃和褥疮性溃疡。花生四烯酸（arachidonic acid，AA），是众所周知的炎症介质，其代谢与多种肿瘤发生有明确的因果关系。
    在AA代谢途径中，两个最重要的限速酶分别是环氧化物酶（cyclooxygenase，Cox-2）和5-脂氧化物酶（lipoxygenase，5-Lox），其相关代谢产物前列腺素E2（prostaglandinE2，PGE2）和白三烯（leukotrieneB4，LTB4）是最关键的炎症调节介质，前者与前列腺素E受体（prostaglandin E receptor，EP）相互作用；后者作用于白三烯B4受体（leukotriene B4 receptor，BLT），推动炎症进展，改变炎症区域内细胞的生物学行为导致恶性肿瘤的发生。
    研究发现，姜黄素和乳香酸都可以抑制口腔鳞癌细胞Tca8113的增殖，并促进其凋亡。乳香酸只能抑制5-Lox通路，姜黄素可以抑制炎症代谢双通路，二者联合应用的抑制效果最佳。二者联合使用可以在预防OSCC方面起到突破性进展。
    4.小结
    综上所述，姜黄素的药理作用十分广泛，可以调控对OSCC细胞发生发展至关重要的多条信号通路，对正常细胞不良反应低，还可与其他药物共同作用于OSCC细胞。姜黄素调控OSCC细胞潜在的靶向蛋白也经常有新的发现，例如AnnexinA2和CDKN2B，充分说明姜黄素在治疗和预防OSCC方面展现了巨大的潜力和优势。
    但目前姜黄素生物利用度低、溶剂和载体具有毒性的问题亟待解决，且存在姜黄素作用于OSCC细胞的其他信号通路、靶向作用更好的姜黄素衍生物、姜黄素的最佳治疗浓度等问题。期待未来进一步研究，早日攻克这些难题，为姜黄素应用于OSCC及更多癌症的临床防治中提供新的思路。