微流控芯片在牙周领域中的应用及展望

    牙周病是一种由微生物引起的慢性炎症性疾病，不仅可能导致牙齿脱落，还可能导致全身性疾病的发生，如阿尔茨海默症、心血管疾病、糖尿病等。及时诊断早期牙周病，并对其加以控制和治疗，对口腔乃至全身健康具有重要的意义。本文从微流控芯片相关概念和技术出发，对该装置在牙周病的诊断与治疗中的应用情况做一综述，并展望其未来在牙周领域可能发挥重要作用的方向，为相关领域的研究人员提供试验思路与参考。
    1.微流控芯片实验室概述
    微流控芯片（microfluidics）又称芯片实验室（lab-on-achip，LOC），是以分析生物和化学为研究对象，将该领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的封装芯片上，形成微通道网络，以可控流体贯穿整个系统，用以替代常规生化实验室各种功能的一种装置，它的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和大规模集成，能够以更高的灵敏度快速检测分析物。
    目前微流控芯片主要应用于感染性疾病的即时检测（point-of-care testing， POCT）、脑神经研究、早期癌症筛查及血管性疾病治疗等医学领域。近年来，随着技术不断地发展并趋于成熟，研究者将目光聚焦于微流控芯片在牙周领域中的应用，并逐渐成为新的研究热点，下面将逐一介绍微流控芯片在牙周病诊断与治疗中的应用前景。
    2.微流控芯片与牙周病POCT诊断
    即时检测（point of care testing，POCT）是一种能在患者床旁、病房或者传统实验室之外的地方进行的快速检测分析技术，它可以在采样现场即刻进行分析。与传统实验室检测相比，POCT在临床检测中具有操作简单化、标本用量少、成本低、耗时较短等优势，目前已广泛应用于临床治疗和病情监测。
    牙周治疗的首要目标应是早期诊断和干预。然而，目前临床上的牙周诊断技术缺乏识别牙周病进展高风险患者的能力，且难以监测病变的微小转变，因此需要开发牙周病诊断的新方法。
    近年来，研究人员在改进原有的诊断技术及发展新技术方面进行了大量的探索，牙周病的诊断方法正向敏感、精确、快速的方向发展，如POCT 定量检测。相比于传统的牙周探查，POCT定量检测有其独特的优势：（1）检测样本多为唾液，可以由医学或非医学人员随时收集样本，安全无创；（2）样本量需求少；（3）多路检测；（4）便携、操作简单且快速；（5）成本低，可用于广泛筛查、诊断和监测。
    由于微流控芯片微型化、集成化、自动化的特性高度契合POCT检测技术的发展需求，采用微流控芯片进行牙周病的POCT诊断近年来已日趋成为POCT领域的研究热点。
    2.1 POCT芯片快速检测牙周致病菌
    以往的研究显示某些细菌是重度牙周炎易感性的有力指标，即病原菌在唾液中的水平可以用于评估牙周病的活动性以及预测其进展，因此检测唾液中的牙周致病菌是一种潜在的牙周病诊断方式。然而，传统牙周致病菌基因定量检测主要采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction， qPCR），但该方法耗费成本高、检测速度慢。
    为解决这些问题，有学者尝试将传统的牙周致病菌分离鉴定技术与微流控芯片相结合以快速、准确地检测牙周病原菌，并通过一系列研究探索牙周病临床诊断的新方法。目前比较公认的牙周可疑致病菌包括牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis， P.gingivalis）、齿垢密螺旋体（Treponema denticola， T.denticola）、福赛斯坦纳菌（Tannerelaforsythia， T.forsythia）等。
    Li等在受试者上中切牙的牙周袋内收集龈沟液，并基于集成的连续流聚合酶链反应（continuous flow polymerase chain reaction， CF-PCR）和电泳生物芯片，制作了一种便携式一体化微流控设备，可快速诊断龈沟液内的牙周病原体。装置不仅实现了P.gingivalis、T.denticola以及T.forsythia DNA的快速扩增和PCR产物的现场定量检测，而且实现了样品的自动注射。该装置仅用2分31秒成功扩增T.denticola，3分43秒内完成PCR产物的检测。
    此外该装置的标本用量少，可检测的最小细菌菌落数为125 CFU/μL。该实验证明了CF-PCR 微流控芯片具有应用于现场核酸检测以诊断牙周病的潜力，促进病原体诊断和基因研究的发展，未来有望将CF-PCR芯片转化至临床应用。
    2.2 POCT芯片快速检测牙周病生物标志物
    以往研究认为生物体液中的炎症介质水平是判断牙周组织炎症活动的良好指标，牙周病患者口腔中的唾液含有牙周病诱导宿主产生的炎症介质，这表明唾液检测具有评估牙周病患者炎症状况和风险以及作为牙周病诊断方式的潜力。以往检测蛋白质表达最可靠和常用的方法是酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）， 但该方法存在样本和试剂反应时间长、操作技术难度大以及设备昂贵等问题。
    Herr等设计并开发了一个用于口腔诊断的集成微流控平台（integrated microfluidic platform for oral diagnostics，IMPOD），该平台可用于对唾液样本进行即时、快速的分析。此外，该研究团队在另一项研究中将唾液样品预处理与电泳免疫分析相结合，耗时仅10 min便可测量经最低限度预处理的唾液样品中分析物的浓度。
    MMP-8被认为是牙周病主要的组织破坏酶，研究人员采用POCT 芯片与ELISA 法分别检测了健康人与牙周病患者唾液中MMP-8的水平，结果显示两种方法测量出的MMP-8水平具有一致性，健康人的MMP-8水平显著低于牙周病患者且牙周病患者中MMP-8的水平与牙周病破坏的程度具有线性相关性。该结果支持MMP-8可能与牙周病活动有关，是判断牙周病严重程度较理想的生化指标。
    唾液中有一种由内皮非合成酶释放的一氧化氮产生的抗菌物质——亚硝酸盐，其浓度与牙周组织的临床症状呈负相关，可以作为牙周病进展的一个指标。亚硝酸盐的定量分析有许多种方法，其中分光光度法在简单性、仪器需求、成本和灵敏度之间提供了一个适当的平衡，虽然该方法已被广泛使用，但缺点是需要分光光度计、较多的试剂及大样本量。Bhakta等设计并制造出一种微流体纸基分析设备，该装置可以帮助建立唾液亚硝酸盐水平和牙周炎之间的关系。最终结果显示微流体纸基分析设备可以准确地测量出受试者唾液中亚硝酸盐的浓度范围并与传统分光光度计测量结果呈线性关系。
    3.微流控芯片与牙周病相关治疗研究
    牙周病的治疗关键是控制菌斑、消除炎症。目前的治疗方法主要包括基础治疗、药物治疗、手术治疗以及新技术应用等。近年来，微流控芯片应用于牙周抗菌治疗，特别是对菌斑生物膜的影响研究较多。为了更好地了解生物膜的发生发展特性，Brann等设计并制造了一个微流控可视化芯片，并利用该新型成像芯片和白光干涉术（white-light interferometry，WLI）监测龈下菌斑生物膜结构的变化。WLI成像原理是依靠迈克尔逊式白光干涉成像系统的干涉物镜能够收集数据，用于构建样本表面的三维轮廓。
    Brann等人的研究显示，采用该芯片所成图像可以展现菌斑生物膜在不同时间的发展情况，结果显示菌斑生物膜的发展是从独立的小菌斑逐渐发展、融合为大的菌斑且菌斑厚度也随着时间的推移而增加。WLI成像有助于监测生物膜发育的早期阶段和成熟生物膜结构的细微变化。
    未来，WLI和微流控芯片可能用于测试生物膜特异性治疗的有效性，以对抗与生物膜形成相关的牙周疾病。Belibasakis等利用微流控芯片技术探究龈下菌斑生物膜对牙龈上皮细胞间连接相关的62个基因表达的影响，结果显示龈下菌斑生物膜对紧密连接、贴壁连接和缝隙连接的表达影响有限，但对上皮细胞间桥体成分的基因表达有较大影响。该研究不仅证实了龈下菌斑生物膜可以下调牙龈上皮细胞间的桥粒连接，损害牙龈组织的结构完整性，有利于细菌入侵和慢性感染，还证明了微流控芯片未来可以应用于龈下菌斑生物膜模型相关的各种研究，如基因表达等。
    随着基因组计划的快速发展，基因芯片与高通量测序技术在全基因组和转录组的测序、疾病的基因层面机理探究等方面应用广泛，虽然新兴技术拓展了样本量检测下限，并具有多样性、并行性、自动化等优点，但现有技术仍存在不足之处。基因芯片是针对已知微生物设计的寡核苷酸探针，并不能检测未知微生物，且目前基因芯片采用定性半定量的快速检测方法，对于需要定量检测的微生物仍需借助实时荧光定量PCR技术才能实现；高通量测序技术在测序覆盖度、均一性、可重复性、精确性等方面存在一定的缺陷，同时还存在成本昂贵、运行时间较长等问题。
    相比于前述方法，微流控芯片集成度高、准确度好、试剂消耗低、反应速度快，目前已有相关研究通过微流控装置进行人牙髓干细胞和牙周膜干细胞的单细胞RNA 测序分析、评价肿瘤药物疗效、转染mRNA、高通量筛选、检测多种肿瘤生物标志物以及基因的表达情况等。未来微流控芯片有望通过与单细胞测序等新兴技术联合，代替传统生物实验室操作，帮助科研人员更简便更准确地完成试验。
    4.展望
    微流控芯片由于其集成度高、准确度好、试剂消耗低、反应速度快等优势，成为构建多种疾病预防、诊断及治疗系统的核心装置。它不仅可以同时检测并分析唾液中的多种生物标志物，还提高了测试的灵敏度和特异性，有望推向临床，成为正式的牙周病诊断新方法。此外，微流控芯片快速集成的优势有望帮助其取代传统的生化试验室，成为基础研究实验的新模式，同时随着微加工技术的迅速发展，其有望提供一体化的复杂检测和诊断功能。
    当前，各种技术，发展迅速，人工智能为口腔生物标志物识别技术提供了新的思路。然而，微流控芯片在牙周病防治方面的应用研究仍然不够深入与全面，需要研究者对此进行深入探索与研究。未来，随着芯片技术的发展和检测手段的提高，微流控芯片在牙周疾病领域应用的深度和广度上将会有更大的提高，有望覆盖口腔乃至医疗行业的各个领域。