浓缩生长因子在活髓保存治疗中的应用前景

    活髓保存治疗是一种用于保存受龋源性、创伤性或机械性损伤的牙髓组织的方法，在牙髓组织受到潜在感染或暴露时，去除坏死牙髓组织，将具有生物活性的盖髓剂覆盖于近髓牙本质或暴露的牙髓组织创面，促进牙髓恢复和第三期牙本质形成，以达到保留和维持剩余牙髓组织活力和功能的目的。其中盖髓剂的应用与活髓保存治疗的成功率密切相关。
    理想的盖髓剂应具备持久的抗菌性、良好的密封性和生物相容性、促进组织修复再生能力以及优越的临床可操作性等特点。目前临床上常用的盖髓材料包括氢氧化钙、三氧化矿物凝聚体（mineral trioxide aggregate，MTA）、新型纳米生物陶瓷材料如iRoot BP Plus、Biodentine、calcium enriched mixture cement（CEM） 等。
    有研究将生物活性小分子物质加载于生物陶瓷类材料用于活髓保存治疗，获得良好的修复疗效；胡玉萍等将富血小板纤维蛋白（platelet rich fibrin，PRF） 与MTA联合应用于兔直接盖髓术发现可促进修复性牙本质形成。这类复合型材料有望成为活髓保存治疗的新型盖髓材料。
    浓缩生长因子（concentrated growth factor，CGF） 是继富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP） 与PRF后的新一代血小板浓缩制品，由纤维紧密交织形成复杂三维（three dimensional，3D） 网络结构，内含丰富的纤维蛋白及大量生长因子等生物活性小分子物质。
    目前大部分研究和综述着重关注其在促进骨组织修复方面如颌面骨修复、口腔种植体修复等的研究进展，然而CGF在促进其他组织的修复与再生中仍具有相当的潜力，Li等总结了CGF在牙髓再生中的应用并指出其在炎症微环境可发挥作用。
    有研究发现CGF可降低炎症牙髓中炎症因子的表达，提示CGF联合生物陶瓷类材料应用于活髓保存治疗有可能促进炎性牙髓修复再生。本文就CGF的发展历程、制备方法及活性成分进行归纳，总结其在组织修复再生中的应用，并将CGF在活髓保存治疗的相关研究进行综述，以期为生物陶瓷类材料联合CGF应用于活髓保存治疗的进一步研究提供思路。
    1.CGF 的制备及活性成分
    1.1 血小板浓缩物的发展历程和制备
    血小板浓缩物的发展经历了PRP、PRF、CGF3个阶段。1984年，Assoian等报道了PRP及其制备方法，根据血液中各组分沉降系数不同，加入抗凝剂的全血经密度梯度离心后分为3层（上清液层、血小板层及红细胞层），上清液层及血小板层再次离心并弃除上清后得到含有大量血小板的血浆，最后与10%氯化钙、牛凝血酶混合即为PRP。该过程可释放大量生长因子用于组织修复再生，但外源性凝血酶的应用存在伴发凝血系统紊乱的风险，其安全性受到一定的质疑。
    PRF 是Dohan 等提出的第2 代血小板浓缩物，即新鲜的静脉血经过1次定速离心（2 700~3 000 r·min-1，10 min），纤维蛋白原发生缓慢聚合，形成三分子立体网架结构，主要包括贫血小板血浆层（platelet poor plasma，PPP）、红细胞碎片层及两者之间的富含血小板的纤维蛋白凝胶，分离后取中间层即为PRF。
    通过对静脉血的差速离心获得了第3代血小板浓缩物CGF。与PRF相比，CGF的制备过程亦无需添加任何化学制剂，采用的2 400~3 000 r·min-1变速离心技术可增加血小板间的碰撞率，从而提取出体积更大、强度更高、黏性更强、生长因子浓度更高的纤维蛋白凝块。
    经特定的变速离心程序后，血液样本由下至上分别为红细胞层、纤维蛋白凝胶层及血清3层。其中纤维蛋白凝胶层即CGF。相较于PRP，CGF和PRF无需添加抗凝剂或其他生物添加剂。PRP在提取后第1小时内释放近95%的生长因子，需在4 h内新鲜制备和使用。CGF及PRF存在立体网架结构，能持续释放生长因子。经变速离心获得的CGF较PRF形成的纤维结构更密集，释放生长因子浓度更高且时间更长。因此，CGF作为第3代血小板浓缩物具有制备安全、作用时间长、能释放大量生长因子等优势。
    1.2 CGF 的活性成分及其作用
    CGF主要通过其纤维蛋白网状支架及高浓度的各类生长因子在组织修复再生中发挥作用。CGF中通过差速离心聚合形成的3D纤维蛋白立体网架孔隙大、弹性好，有利于细胞因子的嵌入和细胞迁移。进入体内环境后，纤维蛋白网架被胶原酶等逐渐降解，可实现生长因子的持续缓释，延长有效作用时间，有利于受损组织的修复。
    扫描电镜下CGF中可见纤维紧密交织形成的3D网络结构以及网内弥散分布的血小板和白细胞。CGF上还存在一定量的CD34阳性细胞，可增强其促进新血管生成、胶原合成、上皮和表皮再生的作用，以及提高对损伤止血的反应能力。
    此外，经差速离心激活后，血小板的α颗粒可以释放各种生长因子，主要包括以下几类：血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、转化生长因子- β （transforming growth factor-β，TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor， FGF）等。这些生长因子能促进血管生成（VEGF、PDGF等）以及成骨/成牙本质向分化（PDGF、BMP、EGF、FGF等）。
    Zhang等研究发现，PDGF可增强人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs） 的迁移、增殖和成牙本质向分化能力，且促进hDPSCs分泌VEGF，提高牙髓血管修复再生潜能。人PDGF与MTA联合进行盖髓治疗后可形成较MTA组更厚且均匀的成牙本质样组织。
    Matsushita等观察VEGF对人牙髓细胞趋化性、增殖及分化能力的影响，结果显示：小剂量的VEGF能诱导牙髓细胞迁移及成牙本质向分化，同时调控成骨细胞的增殖和分化。CGF中的生长因子之间可能存在相互协同作用，促进组织再生和损伤修复，然而相关的作用及其机制有待进一步研究。
    2. CGF 在组织修复再生中的应用研究
    近年来，CGF以凝胶、半凝胶、浸提液或薄膜等形式逐渐应用于不同的临床领域如创面修复、美容治疗及口腔医学等。静脉血经变速离心后，使用剪刀将纤维蛋白凝胶层（即CGF） 与红细胞层分离，可直接以固体凝胶形态或压缩成薄膜形态使用。Kao对18例慢性创面采用CGF凝胶/膜治疗，结果发现16名患者创面处观察到明显的肉芽组织和再生表皮修复，另外2名小腿静脉溃疡患者由于合并静脉血栓导致治疗失败。
    在美容治疗中，Zhou等将CGF凝胶应用于裸鼠皮肤光老化模型，1个月后发现，CGF可显著改善光老化小鼠的皮肤外观和结构，促进细胞增殖，对皮肤衰老有治疗作用。此外，有学者对CGF在口腔组织再生领域的应用进行5年回顾性分析，证实CGF具有良好的生物相容性，并可减轻疼痛，促进组织愈合。
    在牙周组织再生中，Akcan等将CGF放置于牙周翻瓣后暴露的牙根表面用以治疗牙龈退缩，结果表明：CGF可减轻翻瓣术后疼痛，并促进牙龈组织修复。Pirpir等在上颌前牙种植术中使用CGF可促进种植体稳定性，并加速骨组织愈合。但有研究显示，CGF有限的稳定性和一定的溶解性还不足以持续支持组织修复再生。
    Akcan等指出自体结缔组织移植治疗牙龈退缩在改进角化龈宽度、厚度及根面覆盖率的远期临床疗效优于CGF膜。在种植体周围炎的手术治疗中，术后12个月植骨材料联用胶原膜在治疗牙龈愈合及骨再生方面的临床效果比CGF膜显著。因此，目前有研究将CGF与各种细胞、固体支架或胶原膜等联合应用。
    Honda等将CGF与大鼠骨髓基质细胞结合应用于大鼠颅骨缺损修复，早期组织病理学结果显示在缺损部位的外围和中心均发现骨形成及丰富的新生血管形成。12周后骨缺损几乎完全闭合，新骨组织中证实存在骨髓，形成与正常颅骨组织相似的结构。在Chen等的研究中，CGF和胶原分别与大鼠骨髓基质细胞结合，并植入大鼠颅骨缺损处，3个月后micro-CT结果显示：CGF组较胶原组可促进更多新生骨形成。
    此外，Yu等将CGF与脱蛋白牛骨矿物质或纤维内矿化胶原支架联合使用，发现CGF与纤维内矿化胶原支架结合可在14~28 d内释放更多生长因子且持续时间更长。Bonazza等的研究结果显示，CGF与β-磷酸三钙混合使用能够增加BMP-2和BMP-7的释放，诱导成骨并增强骨活性。由此可见，CGF可有效促进组织缺损的修复，并且减轻患者术后反应，但由于CGF远期疗效的不稳定性，其与细胞或支架材料联合使用可能促进其中生长因子的持续释放，诱导组织修复再生，在组织修复再生领域具有潜在的应用前景。
    3. CGF 应用于活髓保存治疗的研究
    CGF凝胶中含有白细胞及大量生长因子，不仅能减轻炎症反应，还可有效促进组织结构的修复再生，因此逐渐在活髓保存术治疗牙髓损伤的应用研究领域获得关注。体外研究显示，CGF能提高牙髓细胞、hDPSCs等的增殖、迁移及成骨/牙本质向分化能力。Dou等评估了CGF、PRF与传统盖髓材料Ca(OH)2及钙硅基类盖髓材料MTA、iRoot BP等对牙髓细胞毒性、增殖、凋亡及矿化能力的影响，发现除Ca(OH)2外，包括CGF以内的其余材料均具有良好的生物相容性。
    在刺激第3天和第7天，CGF组的牙髓细胞相较于MTA/iRoot BP组表现出更高的增殖率。Jun等证实，在体外条件下，CGF促进牙髓细胞的VEGF、PDGF和趋化因子受体4 （chemokine receptor 4，CXCR4） 表达，同时提高人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移能力，促进血管结构的形成。
    Jin等检测添加CGF的条件培养基对hDPSCs增殖、迁移及成骨向分化的作用，结果显示，添加CGF的培养基可促进细胞增殖和迁移，且能更有效地形成矿化结节；第5天和第9天碱性磷酸酶活性升高，第14天时成牙本质相关基因牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP） -1和牙本质涎磷蛋白（dentin saliva phosphoprotein，DSPP） 等明显上调，表明CGF能促进hDPSCs成牙本质向分化。
    Xu等利用脂多糖模拟炎症环境，发现CGF可促进炎症状态下牙髓细胞的增殖及迁移，并显著下调脂多糖刺激下白细胞介素-8及肿瘤坏死因子-α的表达，提示CGF可能减轻牙髓炎症并促进牙髓组织修复，为CGF应用于牙髓损伤的活髓保存治疗提供研究依据。有研究将CGF应用于牙髓再生治疗以促进牙根继续发育。
    Xu等将CGF膜植入Beagle犬根尖未闭合的前牙，8周可见根管内形成含有血管、神经、呈栅栏状排列的成牙本质细胞的牙髓样组织，同时根管管壁增厚且出现根尖闭合。张诗韵等将CGF或血凝块植入裸鼠体内，CGF较血凝块诱导更多神经纤维及血管形成。Nivedhitha等对2例根尖发育不全的恒牙行CGF联合牙髓再生技术治疗，在1年的随访中，锥形束CT评估证实患牙根尖明显闭合且根部牙本质厚度增加，根尖周围病变范围变小。
    此外，临床研究结果显示，CGF联合牙髓再生技术治疗恒牙根尖发育不全合并牙髓病的成功率为71.4%。基于CGF对牙髓组织的修复再生及减轻炎症等作用，学者们开始将CGF作为盖髓材料以封闭暴露牙髓及促进牙髓组织修复再生。Tian等使用CGF、MTA及Ca(OH)2 对Beagle 犬牙进行直接盖髓，3个月后X线片显示：CGF组可形成较少牙本质桥，甚少出现髓腔或根管缩窄，且均无根尖病变；组织病理学显示：CGF组形成薄的钙化屏障，且牙髓成牙本质细胞排列整齐，而Ca(OH)2和MTA组形成厚的钙化屏障，部分成牙本质细胞消失。
    在血小板浓缩物与生物陶瓷材料联合应用方面，已有研究将PRF联合MTA作用于兔直接盖髓，锥形束CT结果显示：术后1周及4周穿髓孔下方可形成斑块状钙化物，且相较于单独盖髓组钙化物体积更大，此外根管内未见明显钙化。然而，尚未有CGF与生物陶瓷材料联合应用修复牙髓损伤的体内报道。因此，体外实验显示：CGF在一定程度上可减轻牙髓炎症，并能有效促进牙髓细胞增殖、迁移、成骨/牙本质向分化及血管形成。
    同时，体内研究表明，CGF直接盖髓可有效促进牙本质桥形成，CGF作为第3代血小板浓缩物，单独或联合生物陶瓷类材料等应用于牙髓损伤的治疗具有一定的潜力，在活髓保存治疗中具有良好的应用前景。
    综上，CGF来源于自体，使用方式多样，临床应用较安全广泛。此外，CGF具备独特的纤维网架结构及大量生长因子，单独应用时能显著促进组织愈合、减轻炎症反应，作为支架与细胞、其他材料结合使用可增强其效能。CGF可与生物陶瓷盖髓材料联合应用于活髓保存治疗，除了作为纤维支架稳定负载盖髓材料，二者结合能更好地减轻炎症及促进组织修复再生。
    但就目前的研究结果而言，CGF作用于牙髓组织修复的机制尚未阐明，大多数研究集中在其中某个生长因子的作用。此外，如何提高CGF的稳定性，促进其内生长因子的持续释放也是CGF应用于活髓保存治疗的研究方向。因此，未来对于CGF在活髓保存治疗中的研究一方面需要进一步探索CGF中多种生长因子协同作用的机制，另一方面需要展开更多体内外研究、临床试验及随访观察，以期为活髓保存治疗提供新的思路。