丝素蛋白支架在颅颌面组织中的应用

    现阶段，利用再生支架对颅颌面组织与功能进行修复已成为组织工程修复策略的三大重要因素之一。随着组织工程技术的发展，具有良好生物学结构和功能的天然蛋白衍生材料受到科研者的青睐。丝素蛋白是一种从桑蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有良好的生物相容性、可调的机械强度和降解性、一定的促成骨能力等特点。此外，丝素蛋白还可以负载细胞、生物活性因子以及药物。
    丝素蛋白已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用，是一种极具发展潜力的医学材料。丝素蛋白最早应用于临床的手术缝线中，近年，随着丝素蛋白支架在全身器官（例如人工血管、人工肌腱和韧带、人造皮肤等）中的研究应用，其在颅颌面组织中的研究应用也逐年增多。本文将结合丝素蛋白性能特点，综合国内外研究，对丝素蛋白支架在颅颌面组织再生修复中的应用作一综述。
    1.丝素蛋白性能
    丝素蛋白为桑蚕丝提取的天然纤维蛋白，占蚕丝总量的70%～80%。丝素蛋白由丝素蛋白链分子构成的丝素微纤维组成。丝素蛋白链分子含18种氨基酸，包括甘氨酸（Gly，G）、丙氨酸（Ala，A）、丝氨酸（Ser，S）等，主要结构元素是重复的GAGAGS序列。特殊的氨基酸结构序列构成了丝素蛋白的非结晶区（SilkI）和结晶区（SilkII）。SilkI蛋白链排列疏松无序，极性基团较多，分子间结合力较弱，以无规卷曲、α-螺旋及β-转角为主，是一种不稳定的结构。SilkII蛋白链排列紧密，非极性基团较多，以β-折叠为主，蛋白链之间由作用力较强的氢键和分子间作用力结合，是一种稳定的结构。这使得丝素蛋白自身具有一定的机械性能。
    丝素蛋白具有良好的生物相容性，黄泉等就丝素蛋白组织相容性、血液相容性及生物功能进行相关综述。明确丝素蛋白无细胞毒性、炎症反应，既具有抗凝血特性，又不产生溶血效应。且丝素蛋白链C端亲水区域附近有类似精氨酸的氨基酸残基，其表面带正电荷，而细胞带负电荷，可通过静电吸附黏附于丝素蛋白支架表面。这一特性显著区别于其他高分子聚合物，有效提升了丝素蛋白支架的生物相容性。
    同时，丝素蛋白在体内能够被多种酶分解，其分解与体内的免疫系统相关，分解产物为氨基酸，安全无毒性。丝素蛋白的降解性和机械性能都与丝素蛋白晶体结构含量相关，即与β-折叠含量相关。研究表明，较高的β-折叠含量，会增加丝素蛋白材料的机械强度；β-折叠含量越高，丝素蛋白材料的结构越稳定，降解速度越慢。
    在制备丝素蛋白支架过程中，通过改变外界反应条件，可对丝素蛋白支架的机械性能和降解性能进行调节，改变pH值、有机溶剂交联、超声、施加电场等，丝素蛋白分子链不稳定的非β-折叠结构可向稳定的β-折叠结构进行转变。
    丝素蛋白还具有促成骨能力，主要基于丝素蛋白可通过调控Notch信号通路中的Hes/Hey蛋白分化，以此调节Runx-2的转录活性，调控成骨。该性能使得丝素蛋白支架广泛用于骨组织再生工程。除此之外，结合丝素蛋白良好的载体性能，使得丝素蛋白支架在设计、应用上更加灵活，足以满足颅颌面不同部位组织再生支架的需求。
    2.丝素蛋白支架在颅颌面组织再生中的应用
    丝素蛋白支架可以模拟细胞外基质的结构和成分，具有可调节的机械性能和降解性、促成骨性以及良好的生物相容性等，广泛应用于颅颌面组织再生修复中。然而，颅颌面不同部位的组织在再生修复过程中因其组织特点、再生环境等的不同，对丝素蛋白支架所需求的性能不同。
    2.1丝素蛋白支架在颅颌面骨组织修复中的应用
    先天性腭裂及肿瘤、外伤等因素都可造成颅颌面骨的缺损。在骨组织修复过程中，丝素蛋白主要以可承载组织应力的多孔支架形式为主，且丝素蛋白的促成骨能力是主要关注点。然而，丝素蛋白支架在大量骨缺损后的修复能力有限。为了增强丝素蛋白再生支架的促成骨能力，在支架中装载具有促成骨能力的细胞/生物活性因子来提高成骨率，减少引导自体归巢细胞数量不足的问题。
    如在丝素蛋白支架中负载过表达PHF8小鼠前成骨细胞（mouseo steoblast cell line，MC3T3-E1）、miR-335-5pC3H10T-1/2细胞、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨形成蛋白基质-2（bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）或神经生长因子（nerve growth factor，NGF）等来促进颅骨缺损部位的成骨。同时，也可基于牵张成骨术原理，通过外力作用刺激支架上细胞的增殖和分化促进成骨。Woloszyk等使用旋转瓶生物反应器构建了一个机械动态生物环境，在机械力的作用下，丝素蛋白支架上培养的牙髓干细胞矿化能力比静止状态下提升了5倍。
    2.2丝素蛋白支架在牙周组织修复中的应用
    牙周炎发生后，牙槽骨吸收且牙龈组织萎缩。引导组织再生术（guided tissue regeneration，GTR）是目前牙周组织损伤修复最为常用的治疗手段，其治疗方法中，屏障膜的降解速度和机械性能对治疗效果产生显著影响。降解速度太快，机械强度不足，可使膜缺损，软组织发生异位生长；降解速度太慢可造成牙周软、硬组织结合受阻，影响组织愈合。因此，应用丝素蛋白降解速率及机械强度的可调控性可制备成适用于牙周组织再生的屏障膜。
    Rider团队利用反应性喷墨打印技术（reactive ink jet printing，RIJ）通过调控丝素蛋白膜的结晶度和表面特性，来调控屏障膜的降解速度。随着丝素蛋白膜结晶度的提升（结晶度为：25%、33%、50%、66%），降解速度逐渐降低（8d降解损失质量依次为：90%、80%、53%、35%）。Zheng等通过单宁酸（tannic acid，TA）分子间的氢键作用调控丝素蛋白β-折叠的形成，显著提高丝素蛋白膜的机械强度。而且，丝素蛋白膜上由于单宁酸的负载，细胞的矿化能力和原位生长能力远强于纯丝素蛋白膜。
    Serdio等将超声处理和电纺技术相结合形成丝素蛋白（silkfibroin，SF）/聚环氧乙烷［poly（ethyleneoxide），PEO］薄膜，通过调节反应时间调控丝素蛋白β-折叠含量，从而制备出机械性能增强的SF/PEO屏障膜。
    2.3丝素蛋白支架在牙髓-牙本质组织修复中的应用
    牙髓炎和根尖周炎常致使牙髓坏死、牙本质吸收。组织血管化、神经元形成和牙本质沉积是牙髓-牙本质再生的关键形态要求。2011年，Zhang团队曾经在丝素蛋白支架上进行人牙髓细胞培养。结果显示，丝素蛋白支架具有卓越的生物相容性，可明显促进牙髓细胞的增殖和分化，充分说明丝素蛋白支架在牙髓-牙本质组织修复中具有一定的潜力。
    在之后的研究中，研究者发现丝素蛋白支架促进牙髓干细胞形成牙髓-牙本质样组织能力有限。为了促进牙髓-牙本质的修复，利用丝素蛋白载体性能装载生物活性因子可达到理想效果。Yang等将参与牙髓修复/再生所有阶段的碱性成纤维细胞生长因（basic fibroblast growth factor，bFGF）负载于支架上，明显促进了牙髓干细胞在支架上形成血管样组织和牙本质样组织。
    据报道，自噬广泛存在于基质细胞源性因子-1α（stromal cell－derived factor-1α，SDF-1α）介导的牙髓干细胞的增殖、迁移以及分化过程中，且与血管生成、神经分化和成骨密切相关。因此，在丝素蛋白支架上负载自噬激动剂SDF-1α可促进牙髓干细胞的增殖、分化。针对临床应用现状（例如根管难以彻底灭菌，根管形状、大小多变等）以及丝素蛋白促牙髓-牙本质样组织修复能力不足等问题，
    本课题组设计了可时序性药物释放、多功能的可注射性微球-水凝胶支架体系应用于牙髓-牙本质再生修复中。该体系第一阶段释放抗生素抵抗根管残留细菌，第二阶段释放小分子药物促进牙髓-牙本质的再生，达到时序性药物释放，发挥牙髓-牙本质修复过程中不同阶段的多种性能需求。可注射微球-水凝胶体系更加适用于形状不规则、狭窄的根管系统，小分子药物的使用弥补了生物活性因子易失活的不足，降低了生产成本。
    2.4丝素蛋白支架在种植体周围骨组织修复中的应用
    口腔种植手术后常会因为感染影响种植体与骨结合，导致种植失败，因此控制感染至关重要。丝素蛋白具有良好的载体效应，可负载抗菌药物形成缓释体涂层薄膜，通过与种植体相结合，有望提高种植体的抗感染能力。Elia等曾用电沉积和融化电凝胶方法将丝素蛋白修饰到钛钉表面，形成均匀、可控的（厚度为35～1654μm）涂层，并呈现出了良好的机械性能，增强了钛钉与骨的结合作用。
    在此基础上，Zhou等用丝素蛋白涂层膜作为抗菌药物载体，制备了银纳米颗粒（AgNPs）/庆大霉素（Gen）的丝素蛋白基仿生涂层。该涂层中的药物可持续释放28d，高效抑制了金黄色葡萄球菌的黏附和增殖，抗菌效果提升了10倍。而且，该涂层在种植体表面的修饰还明显促进了骨细胞的成骨活性。通过进一步改进，该团队将抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）替代Gen，制备形成负载AgNPs/AMPs的丝素蛋白涂层薄膜，依旧维持了高效的抗菌性能，且AMPs增强了种植体的骨整合能力。
    3.丝素蛋白支架应用前景及现存挑战
    丝素蛋白作为一种较为成熟的天然材料，在颅颌面组织再生修复中呈现出了良好的应用前景。首先，丝素蛋白支架自身一定的机械强度和促成骨能力有助于骨、牙本质等硬组织的再生修复。其次，牙周组织修复中，丝素蛋白用于引导组织再生屏障膜的制备，其生物降解性可减少二次手术取模带来的风险。
    利用其可控的降解性，调节丝素蛋白屏障膜降解速度与骨生长周期相一致，可减少因降解太快而造成软组织异位生长或降解太慢引起软硬组织结合受阻。同时，丝素蛋白具有良好的载体性能，可制备成药物缓释体系，既能精确部位给药，又能减少给药次数，延长药物作用时间，适应临床需求。特别是丝素蛋白抗生素缓释体系，这在口腔多菌群的环境以及不易消毒干净的狭窄根管腔研究中具有极其可观的应用价值。
    然而，丝素蛋白也面临着一些挑战。一方面，丝素蛋白溶液不易保存，在环境变化时（如高温或震荡）极易发生分子结构的变化，发生聚集，形成凝胶或沉淀析出。丝素蛋白的易聚集效应会直接影响到支架材料的性能，这给口腔材料使用的即时性带来了很大的挑战。
    另一方面，制备出的丝素蛋白溶液浓度最高不超过30%。当丝素蛋白溶液需要较高浓度时，只能通过透析、超滤等方法进一步的浓缩，这又给材料的制备增加了额外的成本，并带来了污染风险。
    目前，科研者主张采用冻干粉状态进行保存和转运，但冻干获取的丝素蛋白粉溶于水后的β-折叠含量极低，且其原有机械性能也会遭到破坏。针对上述问题，众多研究者已对丝素蛋白的提取、制备及后期保存做了大量研究。但因生产工艺的商业化，具体技术被专有协议保护，相关参数还未公布。随着材料学、生物学以及医学的不断发展，丝素蛋白现存的问题终将会被解决。期待未来能够结合丝素蛋白的显著优势制备出性能全面的再生支架，并将其广泛应用于颅颌面组织再生领域。