无机纳米粒子在牙周病诊疗中的研究进展

    纳米粒子（nanoparticles） 指一维或多维，结构单元的尺寸在1~100 nm的新型多功能粒子，具有较高的比表面积、化学稳定性及机械强度。根据国际标准化组织（International Organization for Standardization，ISO）和美国材料实验协会（American Society of Testing Materials，ASTM） 的标准，纳米粒子一般分为有机、无机和碳基纳米粒子。无机纳米粒子（inorganic nanoparticles，INPs） 指由非碳元素组成的纳米颗粒。金属、金属氧化物、硅等半导体纳米颗粒通常被归为INPs。
    由于INPs粒径较小容易被细胞吞噬，可应用于抗菌、细胞标记等领域。被生物分子修饰后，INPs还会被赋予新的功能，可应用于药物运输及组织再生等领域。本文就INPs在牙周病诊疗中的研究进展进行综述。
    1. INPs 简介
    INPs的结构千变万化，可分为简单与复合结构。简单结构的INPs由超微结构的纳米单元核构成。复合结构的INPs由内核、壳层和表面分子构成，内核是INPs的中心部分，是其结构的基础；壳层包覆INPs的内核，可保护其不被降解，同时还可抑制团聚作用，增强其在溶液介质中的分散稳定性；表面分子可接枝壳层的官能团，使INPs携带生长因子、抗菌物质等生物活性分子，赋予其更多的生物功能。
    人类对于INPs的应用最早要追溯到公元4世纪古罗马时期的卢奇格斯杯（Lycurgus Cup），现今被广泛用于建筑、化妆品、食品加工、生物医药、可再生能源与环境修复等领域。INPs具有比表面积高、化学稳定性较好、生物相容性优良等特点，在医学领域拥有巨大的应用潜力。
    INPs应用于药物运输，可增强疏水性药物的溶解性，延长药物的体内循环时间，增强药物的靶向输送能力，可解决药物的不溶性以及全身非特异性分布等问题；磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs） 作为磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI） 的造影剂，可特异性追踪并监控细胞的位置。金（aurum，Au）、银（argentum，Ag） 及MNPs 可被间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 吞噬，为其提供动态机械刺激，促进MSCs增殖和分化。
    功能化的INPs能有效突破血脑屏障，靶向预防和治疗单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV） 等嗜神经病毒的感染。以花形金纳米粒子为核心材料的免疫层析试纸灵敏度高，可快速检测出谷物及中药内真菌毒素伏马菌素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染。
    2. INPs 在牙周疾病中的应用
    牙周病是人类口腔的常见病、多发病，牙菌斑是牙周病的始动因子。宿主的免疫屏障及炎症细胞具有双重作用，释放出的多种细胞因子，一方面对致病菌产生杀伤作用，另一方面作为炎症介质参与了牙周组织的继发性损伤。当炎症进展至牙周炎时，会导致牙周支持组织丧失。现有治疗方法难以使已破坏的牙周支持组织修复再生恢复到正常状态。NPs在抗菌、调节局部免疫微环境、促进组织再生等方面具有一定的优势。随着研究的深入，NPs在牙周病的诊疗中受到越来越多的关注。
    2.1 牙周病的诊断
    在临床检查中，牙周炎可通过病史采集、影像学检查、牙周组织检查等方法进行诊断。此外，微生物检测是牙周炎的重要辅助诊断方法。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）是慢性牙周炎病变区最主要的致病菌之一。Witkowska等的研究表明：P. gingivalis可以被表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman scattering，SERS） 识别。
    该研究构建了一种银包裹的三氧化二铁（ferric oxide， Fe2O3） 磁性纳米粒子Fe2O3@AgNPs，这种新型纳米粒子可快速吸附到P.gingivalis上，利用MNPs所特有的磁性能，将吸附了Fe2O3@AgNPs的P. gingivalis从样本中磁吸到底部放置铷磁铁的Si/Ag SERS平台上，通过记录SERS光谱进而完成对牙周炎的快速医学诊断。秦尉使用二氧化硅（silicon dioxide，SiO2） 包裹四氧化三铁（ferroferric oxide，Fe3O4） 粒子制成纳米微球Fe3O4@SiO2。
    Fe3O4具有富集与识别混合菌液中微量P. gingivalis的作用，这种纳米微球捕捉P. gingivalis后在外置980 nm近红外激发器的荧光显微镜下显示出绿色荧光，进而特异性检测出P. gingivalis。疱疹病毒（herpes virus，HV） 对牙周炎的致病作用在近年来受到了学术界的广泛关注。
    研究发现：50%慢性牙周炎患者的牙周袋内可检测到单纯疱疹病毒1 型（herpes simplex virus-1，HSV-1）。HV感染可能通过介导牙周局部微环境免疫抑制进而促进牙周致病菌的定植及生长。还有研究将上转换纳米粒子NaYF4:ErYb和Fe2O3磁性纳米粒子包埋至多孔聚苯乙烯微球中，微球通过相连的单克隆抗体特异性捕捉HSV-1，加入另一荧光标记抗体特异性结合与微球相附着的病毒，在波长980 nm的荧光显微镜下呈现绿色，实现HSV-1的分析检测。
    目前牙周炎辅助微生物检查技术主要包括微生物培养和荧光实时定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction， RTPCR），然而这两种技术耗时费力，且技术敏感性较高，同时RT-PCR法也存在假阳性和假阴性的问题。INPs与激光和单克隆抗体技术结合应用，可以快速便捷地检测到目标牙周致病微生物，为随后的牙周靶向药物治疗提供了靶点。
    2.2 牙周抗菌治疗
    牙周炎是细菌感染性疾病，牙周致病菌以菌斑生物膜的形式存在，在牙周组织定植、存活和繁殖，并入侵及破坏宿主牙周组织。去除牙周致病菌是牙周治疗的关键，但在牙周抗菌治疗中，无论是牙周全身或局部用药，都难以避免耐药性及菌群失调的问题。Ag、氧化锌（zinc oxide，ZnO） 等INPs是良好的抗菌剂，可通过破坏细菌外膜和内膜、干扰细菌线粒体呼吸链、产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、耗竭细胞内三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP） 和抑制DNA复制等途径达到抗菌效果。
    银纳米粒子（silver nanoparticles，AgNPs） 的抗菌研究最为广泛，但起到抗菌作用的是AgNPs还是Ag+目前尚存在争议。有学者认为，粒径小于10 nm主要起作用的是AgNPs，粒径大于10 nm起作用的主要是Ag+。Lu等发现：AgNPs对牙周致病菌有明显的抑制作用，且这种作用具有尺寸和剂量依赖性；粒径5 nm的AgNPs对具核梭杆菌的抑菌活性最佳，对伴放线聚集杆菌及具核梭杆菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC） 为25 μg·mL-1。
    Holden等合成了一种由谷胱甘肽（glutathione，GSH）包裹的Ag、Au （质量比Ag∶Au=10∶2） 双金属纳米粒子复合物。在该复合物中，GSH提高了复合物的稳定性，少量的Au可减少复合物对于宿主真核细胞的毒性。研究结果显示：该复合物有效抑制了P. gingivalis的活性。
    Wu等将1%的ZnO纳米粒子掺入甲壳素水凝胶中合成了一种新型引导组织再生（guided tissue regeneration，GTR） 屏障膜，可持续缓慢释放Zn2+，在6、12、24 h时对P. gingivalis有显著的抗菌活性。INPs对牙周微环境内的细菌更多表现为“广谱”抑制作用，其抗菌的核心作用在于促进细菌胞内ROS的产生，从而加剧细胞壁及细胞膜的破坏；抑制线粒体功能的同时，进一步增加氧化应激基因的表达。INPs抗菌研究的逐步深入，为牙周抗菌治疗提供了新的策略。
    2.3 调节局部免疫微环境
    牙周炎活动期局部微环境表现为一种免疫反应失调的状态，内源性炎症因子、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、前列腺素（prostaglandin，PG） 等会引发牙周支持组织继发性损伤。调节牙周局部炎症微环境，使其向着有利于牙周愈合的方向发展，是牙周治疗的目标之一。巨噬细胞受到不同环境刺激时可转化为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，M1型巨噬细胞具有加重炎症、清除损伤部位微生物及伤口碎片的作用；而M2型巨噬细胞可加速炎症消退，促进组织修复。
    金纳米粒子（gold nanoparticles，GNPs）具有很大的抗炎潜力，可诱导巨噬细胞向M2型极化。Ni 等发现：在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 诱导下的牙周炎症微环境下，粒径为13、45 nm的GNPs可有效抑制M1型巨噬细胞相关致炎因子， 包括肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL） -6、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 的表达，并显著促进M2型巨噬细胞相关抗炎因子IL-10、精氨酸酶1 （arginase-1，Arg-1）、转化生长因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β） 的表达；45 nm的GNPs是唯一可以抑制炎症环境下M1型巨噬细胞表面标记物CD86表达的GNPs。
    Li等利用铈（cerium，Ce） 和沸石咪唑-8（zeolite imidazole-8，ZIF-8） 合成一种新型纳米粒子ZIF-8:Ce，发现ZIF-8:10%Ce抑制了M1型巨噬细胞相关炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达，ZIF-8:5%Ce和ZIF-8:10%Ce促进了M2型巨噬细胞相关抗炎因子IL-10、Arg-1的表达。P. gingivalis的LPS可激活NF-κB信号通路引发牙周微环境促炎因子高表达，5%Ce和10%Ce可作为ROS清除剂，抑制NF- κB亚基易位， 进而发挥在牙周局部的抗炎作用。
有研究认为，INPs对于巨噬细胞调节的机制是其与溶酶体内部的高迁移率族蛋白B1 （high mobility group protein B1，HMGB1） 相结合，改变HMGB1的空间构象，抑制Toll样受体9 （Toll like receptors 9，TLR9） 信号通路，进而减少TNF-α的产生，从而发挥抗炎作用。
    2.4 牙周药物载体
    机械去除牙菌斑是治疗牙周病最行之有效的方法，但是遇到窄而深的骨下袋及后牙根分叉病变等器械难以达到感染的最深处，不能彻底清除患处的菌斑，此时药物可作为机械治疗的辅助措施。INPs比表面积高，大大增加了其载药量；而且可被牙周细胞吞噬、内化，提升了牙周药物的靶向运输功能。此外，INPs可改善药物的溶解性并提高其生物利用度，具有抗菌作用的INPs和抗菌药物联合应用可获得协同抗菌的作用。
    INPs作为牙周药物载体近年来受到了广泛关注。牙周局部缓释药物可使牙周袋内保持足够的药物浓度并且维持较长时间。介孔二氧化硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticles，MSN） 孔隙率高，可作为缓释药物载体。Backlund等发现：在MSN释放一氧化氮（nitric oxide，NO） 总量相同的情况下，较慢的NO释放动力学增强了对P. gingivalis和伴放线聚集杆菌的杀菌效果。
    Liu等将聚乳酸/聚乙二醇共功能化MSN集成到可注射型聚乳酸纳米纤维海绵微球，官能团化的MSN具有较大的孔径（15 nm），可负载并局部释放miR-10a、IL-2和TGF-β；将该微球注射到小鼠牙周缺损模型中，可使CD4+T细胞富集、增殖并分化为调节性T细胞（regulatory T cells，Treg），维持局部免疫稳态并降低破骨细胞分化水平，进而减少牙槽骨的吸收。MNPs在外加交变磁场（alternating magnetic field，AMF） 的作用下会引起局部热效应，可作为一种潜在的牙周治疗方法。
    还有学者等将MNPs加入到牙周袋蜂胶药物液晶递送系统中，可减小液晶给药系统的蜂胶释放速度，并提高对白色念珠菌的抗菌活力；当应用交变电磁场时（alternating electromagnetic field，AEMF） 时，增强了给药系统的抗菌活性。INPs在牙周药物的优势主要体现在局部缓释及靶向运输方面，特别是MNPs和外加磁场的联合应用在牙周局部定向给药方面具有极高的研究价值。因此，INPs作为牙周药物载体是很有前景的研究领域。
    2.5 促进牙周组织再生
    牙周炎常导致牙周支持组织（牙骨质、牙周膜、牙槽骨） 不可逆性丧失。牙周基础治疗、牙周翻瓣术、GTR等都难以获得牙周支持组织的生理及功能性再生。INPs是牙周组织工程的新材料，粒径较小，易被细胞吞噬，具有加快细胞损伤修复的作用。不仅如此，INPs可给予MSCs动态机械刺激，通过细胞自噬和上调丝裂原活化蛋白激酶、BMP2/Smad信号通路等机制，促进组织再生。INPs促牙周再生的功效与其粒径大小密切相关。
    Zhang等发现：粒径为13、45 nm的AuNPs可以促进牙周膜干细胞（periodontal ligment stemcells，PDLSCs） 的成骨分化；而5 nm的AuNPs可以抑制碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和矿化结节形成，抑制成骨相关基因ALP、runt相关转录因子2 （Runt-related transcription factor2，Runx2）、Ⅰ型胶原（collagen 1，COL1）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN） 的表达；与13 nm的AuNPs相比，45 nm的AuNPs更能促进成骨分化。
    与此同时，INPs加速组织再生的能力与其胞内浓度呈正相关， 在静磁场（static magnetic field，SMF） 的作用下，MSCs 对MNPs 的吞噬能力增强，释放速度下降；MNPs作用于骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 7 d后，施加SMF组BMSCs内MNPs的含量是未施加SMF组的2倍，MNPs含量维持较高的水平，其分化程度也更高。
    INPs在牙周组织工程中常与生物支架材料联合应用，支架材料可作为INPs和MSCs二者的载体。Ren等发现：在体外，10、50、100 μg·mL-1氧化铈（cerium oxide，CeO2） 纳米粒子促进了PDLSCs增殖并增加ALP、Runx2、骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、OPN等成骨相关基因的表达；同时还发现聚己内酯（polycaprolactone，PCL） /明胶纤维膜为PDLSCs提供了机械支持，并且有助于其迁移到牙周缺损中心部位，进一步加速新骨的形成。
    GTR屏障膜具有阻挡成纤维细胞、上皮细胞及结缔组织贴附牙根面生长的物理屏障作用，但临床上常用的BioGuide胶原膜缺乏成骨特性。将INPs整合至屏障膜可赋予其一定的成骨诱导作用。Peng等采用同轴静电纺丝技术，制备了同轴纳米氧化镁（magnesium oxide，MgO）PCL/明胶核壳复合纳米纤维屏障膜，这种新型的屏障膜具有良好的生物相容性及亲水性，可促进PDLSCs的黏附作用；同时，具有核壳结构的同轴MgO会持续释放Mg2+，促进黏附在表面的PDLSCs表达ALP、Runx2、COLⅠ，大大提升了复合纳米纤维屏障膜的成骨功能。
    牙周炎局部复杂的免疫炎症微环境是牙周组织再生的难题，INPs有抗炎及促进组织再生的双重功效，在抑制牙周局部炎症的同时可通过一系列机制促进牙周组织再生，为牙周再生研究的临床转化提供了新方案。
    3.总结与展望
    INPs作为一种崭新的纳米材料，具有生物相容性好、比表面积高、化学性质稳定、机械强度高、成本低等诸多优势。但是，INPs目前也存在一定的局限性，比如在体内代谢的研究较少，缺乏在人体中长期功效、代谢去向及毒性的研究报告；可能会粘连在血管周围，降低血管的通透性等。未来应着重于INPs在体内的远期功能研究，为其临床转化奠定理论基础。随着INPs的不断改良和发展，在牙周病的诊断、治疗方面具有极大的潜能和良好的应用前景，有望成为牙周领域的理想材料。