种植体表面纳米改性方法及其生物学效应研究进展

    钛及钛合金因具有密度小、比强度高、低温韧性好及抗腐蚀性能优异等特点，被广泛应用于矫形外科及口腔种植等多个领域。材料的表面形貌特征是影响植入后骨结合的重要因素。未经表面处理的钛合金的生物惰性限制了其临床性能和在骨科及口腔科中的应用，主要表现在其与骨组织在结构和性质上不匹配、缺乏骨诱导性等，从而影响钛种植体的初期稳定性及远期成功率。
    为获得理想的种植体表面形貌及提高种植成功率，目前已有多种方法对其进行表面改性，其中纳米尺度的表面形貌因其在结构上与细胞外基质相似，能够很好地模拟细胞生长的微环境，增加早期蛋白吸附及后续细胞的黏附、增殖与分化而引起广泛关注。研究表明，骨组织表面是纳米级与微纳米级结构相结合的粗糙表面，种植体表面纳米改性可形成近似于骨组织的表面形貌，形成促进细胞增殖的微环境，利于干细胞的早期黏附及成骨向分化，增强种植体初期稳定性。
    一方面，通过种植体表面改性处理形成纳米形貌的同时也改善了材料的理化性能，使其具备高表面能，促进早期蛋白层的形成及相关细胞增殖分化。另一方面，纳米材料因尺寸小、比表面积大，其载药能力也比普通材料更强，通过阳极氧化形成的纳米管状结构可负载抗生素、生物肽及多种成骨相关蛋白等，促进早期骨结合，提高种植体初期稳定性。
    综上所述，钛种植体表面纳米改性所形成的粗糙表面可改善骨-种植体界面的应力分布及骨结合，还可负载其他生物活性分子共同促进种植体高效、稳定的植入，具有极佳的临床应用前景。因此，文章就钛种植体表面自纳米化改性方法及纳米结构对细胞生物学行为的影响做一综述，旨在为相关研究及临床转化提供思路与线索。
    1.纯钛表面纳米结构制备方法
    种植体材料表面纳米改性技术可分为以下3类。（1）表面涂覆或沉积技术：在材料表面沉积纳米粒子或涂覆纳米涂层，此技术存在结合强度不够、涂层易剥脱、远期稳定性未知等缺点；（2）表面自纳米化技术：依靠机械锤击或化学改性等技术在材料表面形成纳米结构，此技术依赖材料自身晶体结构的改变，不引入其他成分，具有更高的安全性及临床应用价值；（3）混合纳米化技术：首先通过自纳米化技术在材料表面形成纳米形貌，使其表面形貌及性能发生改变，然后与涂层或化学热处理等技术联合应用，在材料表面负载其他纳米活性分子或形成粒径不同的复合纳米结构。表面自纳米化技术可改善材料自身的理化性质，提高材料的机械性能，具有较强的临床应用前景，是当前研究的热点，以下简要介绍其制备方法。
    1.1 酸/碱蚀刻处理
    酸/碱蚀刻处理是一种化学表面改性方法。酸蚀处理是指将材料在一定温度和湿度等条件下浸泡在强酸溶液中，从而有效地在钛材料表面构建直径为20～100 nm的凹坑结构的方法；碱热处理是指用强碱溶液浸泡材料后并进行高温处理，形成纳米突起状结构如纳米孔、纳米针或纳米棒等的方法。
    研究表明，钛与氢氧化钠溶液反应后可在钛表面形成一层非晶态氧化钠，该层可以加速磷酸钙成核，诱导磷灰石沉积。酸碱蚀刻不会对材料的机械性能（如强度及韧性等）产生影响，且可通过调节处理参数（如温度、浸泡时间及酸或碱的浓度等）来调节纳米结构的形貌及尺度，进而影响相关细胞生物活性，且处理技术简便经济，是当前应用最多的改性方式。
    1.2 阳极氧化处理
    阳极氧化处理是一种有效改善金属表面形貌的电化学方法，在酸性电解液的作用下，腐蚀溶解与氧化沉积交替进行，最终在材料表面形成具有许多均匀的纳米级管状表层结构。这种结构与正常骨组织胶原纤维的排列相似，在生理pH值下，带负电荷的种植体表面可以吸引阳离子形成磷酸钙，促进早期骨整合。
    阳极氧化处理可通过调节电压、电解液浓度及处理时间等方法改变纳米管的管径、壁厚及密度等。阳极氧化是一种简单而经济的技术，形成的氧化钛层具有良好的耐蚀性，且纳米管的尺寸、间距或有序/无序程度均可调控。研究表明，阳极氧化处理所形成的纳米管状结构还可负载抗生素、生物肽及成骨相关因子等，提高其表面生物性能。因此该方法具有极佳的临床应用前景。
    1.3机械加工处理
    包括磨削、喷砂和超声喷丸在内的技术已用于制造粗糙/光滑表面以改善机械特性。机械加工可导致晶粒变形，产生严重塑性形变，从而在种植体上形成纳米级表面，进而提高材料表面拉伸性能、表面硬度和亲水性的同时不会降低材料韧性。激光改性是一种新型微机械加工处理技术，通过热效应和光子效应融化钛种植体表面，可灵活控制材料表面图案，是一种高度可控的加工技术。
    3D激光打印金属制造的多孔钛结构，可精确地获得最佳水平的孔隙率，并且可根据不同的需要通过调整支架内部的孔隙微观结构来改变材料的力学性能。通过激光处理在材料表面模仿昆虫翅膀所形成的仿生纳米形貌，具有天然的抗菌表面结构，可通过切割细菌细胞膜直接杀死细菌，是当前研究的热点之一。
    2.纯钛表面纳米结构分类
    2.1 纳米管状结构
    纳米管状结构是指材料表面垂直排列的致密管状结构。其制备方法包括辅助模板法、溶胶-凝胶法、电化学阳极氧化法和水热法等。在上述制备方法中，电化学阳极氧化法更常用于生物领域。钛在氟基电解液中的电化学阳极氧化可分为3个过程，首先通过氧化还原反应在材料表面形成致密的氧化膜；然后氟离子与氧化层反应形成多孔的薄膜状结构；最后，可溶性络合物形成稳定多孔的纳米管状结构。
    通过阳极氧化形成的纳米管具有明确的、非随机的物理和化学性质，其直径及厚度也具有可复制性。研究表明，材料表面垂直有序排列的纳米管状结构对植入后组织修复与再生均有积极影响。成骨细胞在二氧化钛纳米管表面表现为伸展状态，可能是由于此处表面电荷密度高，纤维连接蛋白与钛表面之间的离子吸引紧密，从而导致整合素介导的细胞黏附。
    此外，二氧化钛纳米管还可通过影响骨髓间充质干细胞和上皮细胞的行为而对种植体骨结合及软组织整合产生影响。在二氧化钛纳米管上培养的人骨髓间充质干细胞和上皮细胞具有良好的黏附性和增殖能力，且通过改变纳米管的形貌特征（如直径、厚度等）可对细胞活动产生不同的影响。
    2.2 纳米凹陷结构
    纳米凹陷结构是指材料表面呈凹坑状的纳米级形貌，主要包括纳米沟槽和纳米凹坑等。纳米凹陷结构可通过电子束刻蚀、酸碱蚀刻等方法制备。当种植体植入后，细胞与材料接触时更易于沿材料沟槽长轴方向生长，因此纳米沟槽可定向引导细胞的黏附增殖。这是由于表面沟槽结构可促使黏着斑黏附在材料表面，使伪足得以伸展。
    同样，高度有序的纳米孔状结构也表现出了优异的促进细胞增殖和成骨分化的能力，有研究通过去除阳极氧化工艺制备的纳米管状结构层而获得了高度有序的凹坑状表面，发现其具有高度的生物活性，碱性磷酸酶活性试验及茜素红染色提示其在成骨的各时期均有正向的促进作用。
    2.3 纳米凸起结构
    纳米凸起结构是指材料表面呈凸起状的纳米级形貌，主要包括纳米球、纳米棒等。纳米凸起可通过水热法、碱热法等与阳极氧化法等相结合获取。不同高度、间距及直径的纳米凸起结构对细胞的影响亦存在差异。研究表明，纳米凸起结构可使材料表面亲水性增强，由纳米凸起所形成的高表面积的粗糙表面有利于早期成骨相关蛋白生成及细胞附着。与纳米管状结构相似，凸起结构处负电荷密度高，可吸附更多带正电荷的蛋白质于材料表面，从而影响整合素聚集，进一步提高成骨效率。
    一般认为，在直径70～300 nm、高度为10～70 nm尺寸范围的纳米凸起能促进种植体周围干细胞成骨向分化及骨整合。体内研究结果显示，钛表面纳米棒阵列可促进间充质干细胞的成骨向分化，当纳米棒状结构间距小于96 nm时可促进体外间充质干细胞功能以及体内骨整合。此外，除促进整合素聚集外，纳米凸起还具有类似于天然骨组织的仿生结构，如纳米棒可模拟羟基磷灰石晶体、纳米球可模拟钙结合蛋白等，具有极佳的生物相容性。
    2.4 梯度纳米结构
    梯度纳米结构是指材料表面晶粒直径从纳米尺度逐渐增加到宏观尺度的结构。此结构常通过表面机械研磨处理制备，通过钢球反复作用锤击，使材料表面产生剧烈的塑性变形从而使表层粗晶逐渐细化至纳米级，产生由表及里的梯度纳米结构。
    电子显微镜下观察处理后的材料由表及里尺寸呈梯度变化，分别为晶粒尺寸为纳米级的剧烈变形层、中间晶粒明显变形的亚微米细晶层和粗晶应变层、粗晶基体层。这种由表及里的结构变化使材料本身理化性质发生改变，避免了涂层及表面沉积在实际应用中的剥脱和分离现象，同时赋予了材料更强的亲水性、蛋白质吸附力以及生物相容性。
    经表面处理所形成的梯度纳米钛材料具有高强度、高化学反应活性、高度耐磨性以及抗疲劳性。相对于毫/微米结构表面，表面机械研磨处理后的梯度纳米结构可促进间充质干细胞早期定植和成骨分化，提高成骨效率。体内外研究均可表明，梯度纳米钛材料具有较高的生物相容性，可促进兔骨缺损模型的骨形成及骨结合。
    3.钛表面纳米改性的生物学效应
    理想的钛种植体需同时具备促进创口愈合、组织再生以及抗菌等多种作用。当种植体植入后，微环境中的多种细胞如树突状细胞、间充质干细胞、巨噬细胞、成骨细胞和内皮细胞等相互影响和调节，影响组织修复和重建。纳米级亲水表面可迅速形成蛋白质吸附层，进而对相关细胞进行信号转导与行为调控，控制细胞对种植体表面的生物学反应，促进种植体周围组织再生与重建。
    3.1 促血管再生
    种植体植入后的创口愈合是个复杂的过程，血管新生在其中尤为重要。新生的血管可携带机体创伤修复过程中所需的细胞因子及营养物质，同时带来相关免疫细胞及免疫因子参与免疫调节，促进早期创口愈合及修复。
    钛表面纳米形貌可对血管内皮细胞黏附、增殖以及生长因子的分泌等生物学行为进行调节，促进创伤后血管重建与再生。此外，种植体周围血管生成与成骨之间的双向调节作用，对种植体早期骨结合具有良好的促进作用。研究表明，钛种植体表面形成的纳米级二氧化钛纤维状网络可促进骨髓基质细胞和内皮细胞的成骨及血管生成分化。
    3.2 促成骨分化
    钛种植体表面纳米结构可促进成骨细胞黏附、增殖及分化，其机制是当前的研究热点之一。种植体植入后，成骨细胞会通过丝状伪足伸展黏附于材料表面，进而启动增殖分化，该过程受材料表面理化性质尤其是表面形貌的调控。
    纳米级表面结构粗糙、亲水性好以及比表面积大，可促进整合素受体蛋白的吸附与表达，调控成骨细胞黏附与聚集。细胞接触材料表面时可产生更大的细胞骨架张力并直接作用于细胞核，促进成骨细胞的早期定植，并以此发挥其促进成骨的效用。
    纳米改性钛材料可促进表面细胞黏附及增多细胞数量，这种效应很可能是由于增加的比表面积、更好的亲水性及增加的管外边缘负电荷所致。此外，纳米级表面可通过改变跨膜整合素的排列方式，影响细胞骨架张力，从而触发生物活性细胞反应，调节细胞的生物学效应如成骨向分化、基因表达及组织再生。表面凹坑状纳米结构已被证实可通过增强β-连环蛋白信号转导促进人MG63成骨细胞分化。
    3.3 免疫调控作用
    种植体植入后，免疫细胞与骨组织细胞相互作用，共同调控种植体周围组织组织愈合与重建。单核巨噬细胞是种植体周围免疫调控的关键细胞，可被激活分化为经典的促炎M1型和旁路激活的抗炎M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞高表达炎症因子[如白细胞介素（interleukin,IL）-12、IL-23、肿瘤坏死因子α及活性氧等]，促进病原微生物的吞噬与杀灭。M2型巨噬细胞分泌大量炎症抑制因子（如IL-10、清道夫受体及基质金属蛋白酶等）参与组织修复与重建。
    早期研究表明钛种植体表面形貌可影响巨噬细胞活性及极化方向。纳米结构钛表面有利于巨噬细胞丝状伪足的伸展，促使其向M2型极化，从而增强巨噬细胞组织修复相关因子的基因表达，具有更强的免疫调控作用。
    3.4 抑菌作用
    研究表明，钛表面纳米改性所形成的不同尺寸及形状的纳米结构具有优异的抗菌活性。此外，由于其表面粗糙、比表面积大，其载药能力也优于普通材料，具有较高的临床应用价值。因二氧化钛纳米管特殊的管状结构，近年来学者们常在小管内搭载抗菌药物来提高种植体的抗菌性能，其表面负载抗菌粒子如银离子、氧化锌等可对革兰阳性和阴性菌产生抑制作用。在其表面负载药物缓释系统可精准调控药物释放剂量、频率等，以达到最佳的临床应用效果。
    4.结语
    综上所述，与未经改性处理的光滑表面相比，纳米结构修饰的钛种植体表面对于组织再生、植入后的抗菌作用及免疫调节均具有正向促进作用。然而，如何确定利于组织修复的最佳纳米表面形貌、尺寸及分布等参数仍是需攻克的难关，临床应选择何种表面形貌的植入材料还有待进一步的临床试验，同时相关分子机制也有待研究与阐述。
    随着纳米科技的发展，钛材料表面纳米化处理工艺也逐渐趋于成熟，近年来，种植体表面仿生纳米形貌逐渐成为研究热点，学者通过激光打印技术模仿昆虫翅膀表面天然抗菌形貌，为种植体表面改性处理研究提供了新的思路，随着研究的扩展和深入，必将对生物医用材料的发展起到极大的推动作用。