牙本质仿生再矿化的研究进展

2017-3-15 16:03  来源:中华口腔医学杂志
作者:王天达 王磊 冯海兰 阅读量:1422

    正常生理情况下,牙本质等牙体硬组织脱矿与再矿化间的平衡影响着牙体组织、口腔功能乃至整个机体的健康。两者间的失衡将影响牙体组织生物力学性能,造成牙体组织缺损,甚或危及患者口腔功能。随着牙科材料及相关技术的发展,复合树脂直接粘接修复技术已成为牙体硬组织缺损的主要修复方法,并得到广泛应用。然而与正常牙本质相比,因龋坏或酸蚀而脱矿的牙本质与粘接剂界面间的微拉伸强度较低,混合层中胶原的降解也可影响复合树脂修复的寿命。为解决这些问题,牙本质仿生再矿化进入了学者的视野。除能在一定程度上提高复合树脂的使用寿命外,牙本质仿生再矿化在牙体缺损修复、口腔功能恢复以及深入研究牙本质生物矿化机制等方面也具有实际意义。现对牙本质仿生再矿化的研究进展进行综述。

    一、牙本质仿生再矿化的理论基础

    1.生物矿物和生物矿化:

    生物机体可诱导生物矿物形成并影响其在组织中沉积的部位和形式。矿化物的形成有利于机体硬组织维持其力学性能和生物学功能。生物矿物虽然组成成分相似,但其矿化程度各异,矿物晶体的大小、形状、排列和组织形式等也不尽相同。由此可见,生物矿物的形成一方面遵循相似的化学原理;另一方面,机体也通过控制局部微环境等方式精密调控这一过程。

    生物矿物常由无机矿化物和有机细胞外基质组成。在生物矿物形成中,细胞分泌的有机基质不可或缺,其中胶原、壳聚糖和纤维素等可发挥细分矿化空间和机械支撑的功能,并可通过界面活化作用决定无机矿物晶体的成核位置、性质和取向。矿物晶体的成核过程还需细胞外基质中蛋白质、磷脂和糖类等有机高分子参与,这些高分子既可与有机结构框架相互作用,又可吸引所需矿物离子,通过减少界面能和降低成核所需的活化能诱导矿物晶体形成。

    2.牙本质生物矿化:

    牙本质由成牙本质细胞产生的生物矿物构成,无机成分主要为羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA),成牙本质细胞分泌的有机细胞外基质中约90%为胶原,其中绝大多数为Ⅰ型胶原。此外,牙本质基质中尚有9%~10%为非胶原蛋白(non-collagenous proteins,NCP),两者在牙本质形成中发挥举足轻重的作用。

    牙本质发生过程中Ⅰ型胶原由成牙本质细胞合成,以三股螺旋的原胶原形式分泌到细胞外基质中,并进一步聚集和组装形成胶原纤维。已有研究显示,胶原纤维的矿化始于胶原纤维间断带,该处兼有带正电荷和负电荷的氨基酸残基,可为钙离子和磷酸根沉积提供三维环境,为HA晶体提供成核表面。间断带构象上的灵活性也有利于其与钙离子和磷酸根结合。但体外环境中HA晶体并不优先于间断带处成核,牙本质等以胶原为基础的生物矿物中晶体率先于胶原纤维间断带处成核这一现象或与NCP相关。

    NCP主要为具有较强钙离子和HA晶体结合能力的酸性蛋白质,在骨组织和牙本质形成过程中起调控作用。小整合素结合配体N端连接糖蛋白(small integrin binding ligand N-linked glycoproteins,SIBLING)是最重要的一组NCP,其一级结构中含大量天冬氨酸、谷氨酸和磷酸化丝氨酸残基,具有较强的酸性,并在溶液中表现为随机开放的构象,这种构象带来的结构自由度可为该家族蛋白质的生物学功能提供结构基础。牙本质基质蛋白1 (dentin matrix protein-1, DMP-1)、牙本质涎蛋白(dentin sialoprotein, DSP)和牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotein, DPP)是主要存在于牙本质基质中的SIBLING家族蛋白质,参与牙本质的发生和生物矿化过程。

    DMP-1富含酸性氨基酸残基的C端可携带较多电荷,此处的两个多肽片段可通过静电作用与胶原纤维结合,为HA晶体提供成核位点,并可诱导矿物晶体成核。在钙离子的影响下,多个DMP-1分子可通过C端形成分子间β折叠,并进一步自组装形成纤维状结构,其可为HA晶体沿晶轴中c轴方向的生长提供结构表面。此外,DMP-1 N端天冬氨酸残基也有利于稳定牙本质生物矿化所必需的无定形矿化前驱体。DPP和DSP是DSPP基因转录产物经蛋白水解酶分解产生的两个不同片段。DPP为牙本质基质中含量最多的非胶原蛋白,与钙离子有较高的亲和力,被认为是一种典型的可调控生物矿化过程的蛋白质,可诱导HA晶体成核和生长。此外DPP还参与调节细胞代谢和基质沉积等过程,并能起稳定牙本质基质的作用。DSP属蛋白聚糖,是牙本质基质中含量仅次于DPP的非胶原蛋白,其上的糖基化位点可通过硫酸软骨素4或硫酸软骨素6与氨基多糖结合,形成酸性较强的高相对分子质量DSP。体外实验显示,高相对分子质量DSP或为牙本质基质中DSP的活性形式,可能在上皮和间充质内充当信号分子而参与成牙本质细胞和成釉细胞的分化过程。

    虽然有机基质在牙本质生物矿化过程中起重要的调控作用,然而大量研究显示,自然界中广泛存在的无定形碳酸钙和无定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate,ACP)等无定形矿化前驱体在生物矿化过程中同样不可或缺。

    对于无定形矿化前驱体以何种形式参与生物矿物的形成,目前有如下两种假说:①生物矿物以溶解-再沉积的方式在胶原支架上形成,即无定形矿化前驱体首先沉积在有机基质的胶原纤维外,继而溶解,以离子形式渗入胶原纤维内形成磷灰石晶体;②液态的无定形矿化前驱体可通过毛细作用和(或)静电作用渗入胶原纤维,继而发生相转化形成矿物晶体。目前学者多倾向于接受第二种假说。牙本质基质中DMP-1的N端天冬氨酸残基可与钙离子结合,起诱导并稳定ACP的作用。在牙本质矿物晶体的成核和生长过程中,亚稳态的ACP可逐渐转变为热力学稳定性更高的HA晶体。在特定环境中,聚天冬氨酸等阴离子聚合物可吸引离子并使其聚集成直经为2~ 4 μm的液态前驱体,这一亚稳态矿物可决定矿物晶体最终的取向和排列。以此为基础,Nudelman等和Jee等分别利用聚丙烯酸和聚天冬氨酸等阴离子聚合物,一定程度上模拟了ACP渗入胶原支架并成核生长的过程,为研究无定形矿化前驱体在生物矿化过程中的作用提供了理论依据,也为牙本质生物矿化和仿生再矿化研究提供了新的思路。

    二、牙本质仿生再矿化的研究进展

    自1960年Steele正式提出仿生学概念以来,仿生研究逐渐受到重视。通过对生物的观察和研究,模仿或利用生物体的结构、生物学功能和生活过程,并进一步将其应用于材料设计中,获得具有类似生物体性能的新材料是仿生材料研究的基本思路和主要难点。牙本质生物矿化过程离不开细胞外基质中胶原和NCP的作用,因此,对牙本质生物矿化的仿生研究主要集中于直接利用胶原诱导仿生矿化物的形成和利用仿生类似物模拟胶原纤维和NCP在牙本质生物矿化中的作用上。

    1.胶原及其仿生类似物诱导的仿生矿化:

    胶原是生物矿化过程中不可或缺的有机基质成分之一,为生物矿物的形成提供了重要的三维支架和成核位点。早期模仿骨组织组成成分和结构的研究着眼于诱导Ⅰ型胶原和重组Ⅰ型胶原在矿化环境中矿化。Glimcher发现HA晶体可在兔胶原间断带处形成。Liao等也成功利用纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸多孔复合材料仿生合成了骨组织类似物。这些研究表明,利用胶原纤维诱导其上矿物晶体的形成是实现骨组织和牙体硬组织等生物矿物仿生矿化最直接的方式,但因胶原较难获取、纯化和保存,这一方法在仿生矿化和仿生再矿化等领域的研究和应用或将受限。目前,学者将目光更多地放于自组装材料在诱导仿生矿化方面的作用上,其中最具代表性的是Hartgerink等合成的自组装双亲性多肽分子,其可在溶液中自组装形成纤维样结构,组装体外围的氨基酸残基含较多磷酸基团和羧基,可与钙离子结合并诱导HA晶体沿纤维样结构长轴定向生长,一定程度上模拟了胶原的生物矿化过程。Kirkham等合成的含11个氨基酸残基且可形成β折叠的多肽,可在pH值较低的环境中自组装形成表面带大量负电荷的纤维样结构,该结构不仅可在体外诱导形成HA晶体,更可在口腔环境下诱导釉质的仿生再矿化。此外,Gungormus等也设计合成了具有自组装作用的多肽分子,并证实其具有促进HA晶体成核和引导晶体定向生长的作用。虽然这些研究的主要目的在于利用自组装纤维样结构模拟釉质晶体的形成过程,但其原理与牙本质生物矿化机制高度一致,因而在牙本质仿生矿化和仿生再矿化等方面具有一定价值。

    2.NCP类似物诱导的仿生矿化和仿生再矿化:

    尽管利用胶原及其仿生类似物可在一定程度上模拟生物矿物的形成过程,越来越多的研究显示,NCP的仿生类似物也具有诱导仿生矿化和仿生再矿化的潜能,其作用主要在于稳定无定形矿化前驱体。

    生物矿化过程中,无定形矿化前驱体的形成先于有机三维支架的矿化,无定形矿化前驱体的稳定是有机三维支架矿化的必要前提。为此,Olszta等创新性提出聚合物诱导的液态前驱体(polymer-induced liquid-precursor,PILP)方法,旨在利用聚丙烯酸和聚天冬氨酸等阴离子聚合物稳定ACP,并进一步诱导胶原纤维内矿物晶体形成,实现生物硬组织的仿生矿化和仿生再矿化。通过PILP方法稳定的无定形矿物可依三维矿化支架结构的不同诱导形成不同分级结构的生物矿物,这在牙本质仿生矿化和仿生再矿化等方面十分重要。以PILP方法为基础,Tay和Pashley利用聚乙烯基膦酸和聚丙烯酸,以三氧化矿物聚合物的活性成分硅酸盐水门汀为钙源,成功诱导了酸蚀脱矿牙本质和树脂渗透脱矿牙本质的仿生再矿化。Liu等利用聚丙烯酸诱导胶原支架纤维内矿化,初步实现了具有骨样分级化结构矿化基质的构建,并进一步证实纤维内矿化胶原支架的杨氏模量高于纤维间矿化者,矿化胶原支架在诱导细胞增殖和成骨分化等方面也有一定作用。此外,Burwell等也成功诱导了人工牙本质龋的仿生再矿化,再矿化牙本质具有与正常牙本质相似的力学性能。

    3.聚酰胺-胺型(polyamidoamine ,PAMAM)树枝状分子诱导的牙本质仿生再矿化:

    三维胶原矿化支架和NCP是牙本质等以胶原为基础的生物矿物形成过程中起决定性作用的两个方面,分别利用其仿生类似物模拟生物矿物形成过程的研究均取得了一定成功。而树枝状分子理论上可同时发挥上述两方面的作用,这使利用该分子诱导简便有效的仿生再矿化成为可能。

    树枝状结构广泛存在于生物界和非生物界,其独特的结构和特点促使学者不断模仿,尤其在大分子合成领域中。PAMAM树枝状分子是合成、表征和商品化最早的一类树枝状大分子,该分子具有分子结构精确、高度几何对称、外围含大量功能基团、分子内存在空腔、相对分子质量可控和分子本身具有纳米尺寸等诸多特点。此外,PAMAM分子还因出色的化学和生物学特性而有人工蛋白之称,其对矿化过程的调控作用也得到深入研究。Yan等发现,外端功能基团为氨基的PAMAM分子可影响水热法合成的HA晶体形貌。在水热法合成HA的过程中,PAMAM分子起改性剂作用,加入PAMAM分子是调控HA晶体生长方式的有效手段。

    PAMAM分子除能影响HA晶体的水热合成过程外,其自身经过不同程度和形式的接枝改性后也能诱导类似生物矿物的晶体形成。Yang等在扇形PAMAM分子中心以烷基链修饰,外端接枝天冬氨酸,构建了两亲性树枝状分子;该分子在水溶液中可形成球形自组装体,之后进一步聚集成链,结构与釉原蛋白体外集聚形成的自组装体十分相似。在过饱和溶液中两亲性树枝状分子可诱导形成具有类似釉柱结构的HA晶体。这一研究证实,以PAMAM分子为基础的自组装结构理论上可作为细胞外基质中三维矿化支架的仿生类似物诱导牙本质的仿生矿化和仿生再矿化。

    PAMAM分子除能模拟三维矿化支架外,也能在一定程度上模拟NCP在牙本质生物矿化过程中的作用。Wang等根据NCP的结构特点,利用曼尼希反应成功合成了磷酸化PAMAM分子。该分子在较低浓度下可促进矿物晶体成核和生长,浓度较高时则转为抑制作用,这与DMP-1等NCP的作用相似。体外研究显示,磷酸化PAMAM分子在溶液中可模拟NCP稳定ACP,并诱导完全脱矿的牙本质胶原纤维仿生再矿化。该课题组还证实整代氨基封端的PAMAM分子通过戊二醛诱导的共价交联作用与完全脱矿的牙本质胶原纤维结合后,可在体外溶液环境中诱导脱矿牙本质仿生再矿化。此外,Li等利用外端功能基团为羧基的PAMAM分子在体内和体外环境中成功诱导脱矿牙本质再矿化。PAMAM在诱导仿生矿化方面的巨大潜能使利用其诱导牙本质仿生再矿化成为可能。

    牙本质是具有特殊组成成分与分级结构的生物材料,目前学者已根据牙本质的生物矿化机制初步建立了利用牙本质基质或牙本质基质中NCP类似物诱导仿生矿化或仿生再矿化的观点,牙本质的仿生再矿化在PILP等方法的理论基础上逐渐发展起来。牙本质仿生再矿化的实现,理论上可提高复合树脂直接粘接牙体修复的使用寿命。PAMAM分子在诱导牙本质仿生再矿化研究上的巨大潜力一定程度上为学者继续探索新生牙本质的方法,并将其用于提高牙本质复合树脂粘接修复寿命等方面提供了新思路,但目前研究多局限于利用PAMAM分子进行体外仿生矿化与仿生再矿化,考虑到口腔环境和复合树脂粘接局部微环境的复杂性,未来还需大量相关的基础和体内研究支持。

编辑: 陆美凤

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