明胶酶与牙髓炎和根尖周炎相关性研究进展

2017-7-10 10:07  来源:中国实用口腔科杂志
作者:李晓琳 仇丽鸿 阅读量:5239

    基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解过程中一组重要的蛋白酶,占ECM降解酶总活性的70%以上,通过降解各种ECM蛋白质参与机体多种生理过程(如胚胎发育、骨改建等)和病理过程(如炎症、肿瘤等)。MMPs是一组结构及功能同源的蛋白酶超基因家族,根据其结构和底物特异性不同可分为6类:胶原酶、明胶酶、基质溶解素、基质降解蛋白、膜型MMP 和其他型MMP。明胶酶包括MMP-2和MMP-9。

    细菌被认为是牙髓炎和根尖周炎的主要致病因素,但大多数组织损伤是由宿主对致病菌的免疫应答引起,而这种免疫反应同时受宿主遗传因素的影响。来源于宿主的蛋白酶在牙髓和根尖周组织破坏过程中起着重要作用。以下对明胶酶与牙髓炎和根尖周炎的相关性做一综述。

    1.明胶酶

    1.1 明胶酶分子结构

    明胶酶的基本结构包括:N-末端的信号肽区,为其正确分泌所必须;前肽区,与酶原活化有关;催化基团区,与前肽区结合可维持酶原状态;C-末端的血红素蛋白结构区,可与特定底物、基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitor of metalloproteinases,TIMPs)等结合,并与其激活相关;铰链区,连接催化基团区和血红素蛋白结构区。MMP-2 即明胶酶A,酶原分子量为72 ku;MMP-9即明胶酶B,酶原分子质量为92 ku。

    1.2 明胶酶基因

    MMP-2 基因位于人染色体16q13-q21,含13个外显子和12个内含子,结构基因总长度为27 000 bp。MMP-9基因位于人染色体20q11.2-q13.1,含13个外显子和12个内含子,全长26 000 ~ 27 000 bp。

    1.3 明胶酶基因调控

    研究表明,明胶酶的表达调节大致有以下3种水平:转录水平、酶原活化水平和酶活性水平。明胶酶在体内的调节处于一种微妙的平衡状态,其表达调控机制并不孤立,而是彼此联系。以上3个环节的相互作用对于维持人体MMPs的稳定具有重要意义。

    1.4 明胶酶基因表达及其表达产物功能

    MMP-2基因表达产物主要由成纤维细胞、血管内皮细胞、浆细胞、巨噬细胞和中性粒细胞产生。MMP-2酶原的活化发生在细胞表面,由膜型基质金属蛋白酶(membrane-type matrix metalloproteinase,MT-MMP)启动,MT1-MMP/TIMP/MMP-2 酶原三元复合物形成后,MMP-2酶原变成相对分子质量为64 ku的中间形式,破坏了MMP-2酶原前肽结构域的稳定性,导致其自发性水解,释放出其余的前肽结构域和活性MMP-2。MMP-9基因表达产物主要由中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞等产生,在炎症介质等刺激后可增加MMP-9基因编码的mRNA及分泌分子质量为92 ku的酶原,在Ca2+和Zn2+存在条件下,经纤维蛋白水解酶作用,切去N-端的80个氨基酸残基肽段后即转变为分子质量为82 ku的活性形式。MMP-2的主要作用底物是Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和明胶。MMP-9的主要作用底物是Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原以及明胶和弹性蛋白等,并协同明胶酶继续降解变性Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原,参与细胞外基质的降解,即结缔组织的重塑和基膜的转换过程;影响骨小梁结构及骨生物力学性质;促进肿瘤血管生成。

    在生理状态下,MMP-2与MMP-9基因表达水平低,参与牙齿形成及萌出、骨组织生长及改建、胚胎发育等;在病理过程中,基因表达水平增高,与慢性炎症和骨吸收病变等相关。

    2.明胶酶与牙髓炎的关系

    2.1 明胶酶对牙髓组织的致病作用

    大量研究证实,细菌成分在牙髓炎发生发展中起重要作用,致病菌除了通过释放蛋白酶直接降解ECM外,还可通过MMPs途径降解ECM,MMPs途径是多种非矿化组织ECM降解的主要途径。炎症牙髓中的细菌内毒素在细菌裂解后释放,具有强抗原性,引起机体的免疫反应导致牙髓根尖周的免疫病理损伤。内毒素可引起中性粒细胞的渗出,激活补体系统,刺激炎症因子的合成与分泌,如白介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)等,牙髓细胞中IL-1和TNF可介导MMP-2形成。Chang等在研究产黑色素类杆菌对人牙髓细胞合成MMPs的影响时,将牙髓卟啉单胞菌(porphyromonas endodontalis,P.endodontalis)和牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)培养后经离心提取的上清液加入到人牙髓细胞培养液中,培养8 d后,明胶酶谱分析发现牙髓细胞合成MMP-2明显增多。

    许多学者通过收集临床病例的牙髓组织进行研究发现,MMP-2、MMP-9在成牙本质细胞和牙髓细胞中均有表达,且在炎性牙髓组织中的表达明显升高。Gusman等通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测人炎症牙髓和健康牙髓中MMP-9的表达水平,明胶酶谱检测明胶分解活性发现,MMP-9在炎症牙髓中的表达显著高于正常牙髓,且明胶分解活性与MMP-9的表达水平呈正相关,指出MMP-9在牙髓炎症发病机制中起重要作用。Accorsi-Men⁃donça等通过明胶酶谱法检测炎症牙髓与正常牙髓样本中MMP-2、MMP-9活性,ELISA 法检测TIMP-2表达水平发现,MMP-2在正常牙髓未见表达,MMP-2前体在炎症牙髓与正常牙髓中的表达差异无统计学意义,但活化MMP-2在炎症牙髓表达上调;MMP-9、TIMP-2 在炎症牙髓表达上调。

    Tsai 等通过半定量逆转录聚合酶链反应分析(semi-quantitative reverse transcriptase polymerasechain reaction analysis,Sq RT PCR)和免疫组织化学方法检测人健康牙髓与人炎症牙髓MMP-9的表达水平发现,人牙髓组织可在转录水平表达MMP-9 mRNA;MMP-9在炎症牙髓中的表达可由细菌直接诱导或炎症因子间接诱导;MMP-9mRNA在炎症牙髓中的表达多于健康牙髓;MMP-9在炎症牙髓中的表达多于健康牙髓,在成牙本质细胞、成纤维细胞、炎症细胞、血管内皮细胞中均有表达,表明MMP-9在牙髓炎症发病机制中起重要作用。

    2.2 明胶酶在牙髓炎诊断与治疗方面的作用

    对龋源性牙髓暴露的牙髓炎病例选择最佳治疗方法十分必要:大面积牙髓感染导致的不可复性牙髓炎应进行根管治疗,而范围较小的牙髓局部感染可采用活髓切断术并在牙髓断面上覆盖生物相容性材料。但在临床诊疗过程中,可复性牙髓炎与不可复性牙髓炎只能通过临床症状区分,如疼痛史、牙髓出血情况等。已有学者证实,通过影像学诊断牙髓炎是错误的,而组织病理学检查只能在取出牙髓之后进行。因此,在炎症牙髓中选择标记物并验证其作为诊断各型牙髓炎的分子标签的可行性广受关注。Zehnder等通过聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)收集不可复性牙髓炎患牙和健康牙牙本质小管液,通过人MMP-9荧光法检测收集液体的MMP-9浓度发现,有症状患牙的牙本质液中MMP-9表达水平显著高于对照组;对照组样本中未检测到MMP-9,表明在牙本质小管液中检测与牙髓组织相关的MMP-9是可行的。

    Mente等通过前瞻性临床试验研究龋源性牙髓暴露的可复性牙髓炎、不可复性牙髓炎及无症状深龋病例,荧光比色酶联免疫吸附试验检测病例组和对照组牙髓血液中MMP-9表达水平发现,无症状深龋组与可复性牙髓炎组的MMP-9表达水平有显著差异,无症状深龋组与未服用非甾体抗炎药的不可复性牙髓炎组的MMP-9表达水平有显著差异,无症状深龋组与服用非甾体抗炎药的不可复性牙髓炎组的MMP-9 表达水平有统计学意义。研究提示,非甾体抗炎药可能降低MMP-9的表达水平;牙髓血液中MMP-9的表达量可作为评估牙髓组织炎症和损伤程度的指标,也可作为临床医生对龋源性牙髓暴露病例选择治疗方案为活髓保存治疗或根管治疗的辅助工具。

    3.明胶酶与根尖周炎的关系

    3.1 明胶酶对根尖周组织的致病作用

    根尖周组织包括牙骨质、牙周膜和牙槽骨。牙骨质和牙槽骨是矿化的组织,有机物约占其1/3,其中Ⅰ型胶原占90%以上,非胶原蛋白仅约占5%。牙周膜中Ⅰ型胶原为数最多,Ⅲ型胶原约占胶原的1/5,还有少量的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原存在。胶原成分的正常组成和结构完整是根尖周组织健康的重要保证。正常生理条件下,细胞外基质降解与合成相平衡,明胶酶的表达量和活性很低,但在损伤性病理过程中(如慢性炎症、骨吸收病变等)明胶酶表达显著增加。

    根尖周炎常伴有骨组织的破坏,破骨细胞起主要作用。破骨细胞在引起骨吸收之前必须穿过类骨质移动到矿化骨表面,在这个过程中明胶酶降解胶原起重要作用;同时明胶酶也是骨基质降解蛋白水解酶之一,参与破骨细胞的移动和骨基质的降解。在生理和病理状态下,MMP-2和MMP-9均降解胶原蛋白。研究发现,MMP-2不仅可降解变性的Ⅰ型胶原,还可降解天然的Ⅰ型胶原,且无TIMP-1存在时,MMP-9可与MMP-1形成复合物,使Ⅰ型胶原彻底降解,而Ⅰ型胶原是骨基质的主要胶原;破骨细胞内可见MMP-2、MMP-9的高表达;MMP-9不仅在破骨细胞的功能活动中起重要作用,且在破骨细胞分化阶段就发挥了一定作用。

    大量研究结果表明,MMP-2、MMP-9在根尖周病表达显著增加。Pereira 等通过收集51例根尖周炎的病变组织,通过免疫组织化学方法检测后发现,MMP-2和MMP-9在所有病例均呈免疫阳性且在根尖周肉芽肿的表达均高于根尖周囊肿。MMP-9在破骨细胞前体的聚集和迁徙过程中发挥作用,MMP-9移除骨表面的胶原层后,骨吸收过程开始。Carneiro等通过根尖手术收集根尖周病变组织,经组织切片、连续切片、苏木精-伊红(HE)染色法染色,显微镜下分析选出有上皮覆盖、无上皮覆盖的根尖周炎病例各10例,免疫组织化学方法检测MMP-9和膜蛋白细胞分化抗原-68(cluster of differentiation 68,CD68);实时荧光聚合酶链反应(real-time polymerase chainreaction,real-time PCR)检测mRNA 水平发现,MMP-9在2种根尖周炎的中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞中均有表达;无上皮病变较有上皮病变MMP-9 表达阳性细胞数量和所占比例更高,CD68阳性结果与之呈正相关;2种根尖周病变与正常根尖周韧带细胞相比MMP-9表达均增加,但MMP-9 mRNA 表达无显著差异;数据显示,以CD68阳性为主的炎症细胞参与根尖周病变MMP-9 表达,表明MMP-9 参与根尖周炎ECM 降解。

    Ahmed等通过HE染色和免疫组织化学方法检测有症状和无症状根尖周炎患牙经根管治疗、根尖手术采集的根尖周病变组织发现,有症状组与无症状组相比,革兰阴性菌和MMP-9染色面积百分数有显著性差异,革兰阴性菌与MMP-9面积百分数呈显著正相关,为革兰阴性菌与MMP-9在有症状根尖周炎中起重要作用的观点提供了依据。提示MMP-9可引起慢性根尖周病患者的疼痛感。有学者发现,MMPs 可能具有抗炎作用。Tjäderhane等通过构建大鼠根尖周炎模型,运用放射线观察病变范围、组织切片进行组织学分析发现,用经化学修饰的四环素药物(chemicallymodified tetracycline 3,CMT-3)喂食大鼠2周、4周后,根管内组织坏死和根尖周炎的病变范围均有不同程度增加,得出MMPs抑制剂可促进根尖周炎发展的结论,提示MMPs可能具有抗炎作用。

    Wan等在MMP-9基因敲除小鼠慢性根尖周炎模型和对照小鼠上通过real-time PCR和免疫组织化学法分析NF-κB 受体激动剂(receptor activator of NF-κB,RANK)、NF-κB 受体激动剂配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)、骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)发现,RANK、RANKL、OPG在MMP-9基因敲除小鼠根尖周病变的表达水平上调,MMP-9基因敲除小鼠炎症反应更强烈、根尖周病变范围更大,表明MMP-9通过宿主免疫和炎症反应抑制牙髓炎和根尖周炎起重要作用。

    3.2 明胶酶在根尖周炎诊断与治疗方面的作用

    近年来,众多学者关注ECM和受体中的特殊蛋白作为探测根尖周炎生物标志物的可行性,期待在根管治疗前提高诊断各型根尖周炎的准确性。有学者指出,在治疗根尖周炎前运用放射线分析法诊断慢性根尖周肉芽肿和囊肿是不确切的,组织学评价是诊断的金标准。de Paula-Silva等认为,由于根尖周炎治愈率较低,因此在进行根管治疗之前若不能区分慢性根尖周肉芽肿与囊肿,将导致预后效果不确切。通过基因芯片分析(microarray analysis)、原位酶谱(in situ zymography)、免疫组织化学方法检测经组织学鉴定后的慢性根尖周肉芽肿、囊肿样本发现,MMP-9主要表达在根尖周肉芽肿的中性粒细胞和慢性根尖周囊肿的单核细胞中,中性粒细胞MMP-9染色区域中根尖周肉芽肿较根尖周囊肿显示出更高的酶活性,提示MMP-9可能作为根尖周疾病诊断的分子标签。Lazar等提出,MMP-9可作为临床检测慢性根尖周炎患病风险的指标及在治疗中运用MMP-9抑制剂的观点。

    Kim等用AH plus刺激大鼠MC-3T3E1细胞,通过MTT法检测细胞毒性;2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐法(DCFH-DA)检测活性氧;ELISA检测一氧化氮(NO)、TNF-α、IL-1β的表达水平;Western Blot检测RANKL、环氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)、MMP-2、MMP-9的表达水平发现,AH plus刺激细胞后,细胞活性和细胞内碱性磷酸酶活性下降,NO、TNF-α、IL-1β的表达水平增加;而茯苓酸可抑制AH plus刺激细胞后NO、TNF-α、IL-1β表达,降低RANKL、COX-2、MMP-2、MMP-9 表达,增加骨形成蛋白BMP-2、BMP-7表达,消除刺激后生成的活性氧,抑制NF-κB核易位。研究结果提示,茯苓酸可减轻AH plus刺激产生的不良后果,降低炎症、骨损伤等口腔疾病的并发症。

    综上所述,各国学者就明胶酶在牙髓炎和根尖周炎致病、诊断、治疗方面进行了不同角度、不同层面的研究,研究结果使我们对明胶酶在牙髓炎和根尖周炎发挥作用的认识提升到了新的高度,对临床工作具有指导意义。但目前为止,明胶酶的致病机制尚未完全明了,其作为牙髓炎和根尖周炎诊断与治疗效果标记物的可行性未经全面证实。因此,针对明胶酶的研究仍具有临床意义。

编辑: 陆美凤

网友评论