牙源性干细胞是从口腔组织中分离出来的成体干细胞，包括牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）、脱落乳牙干细胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、根尖乳头干细胞（apical papilla stem cell，SCAP）、牙囊前体细胞（dental follicle progenitor cell，DFPC）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）等，具有自我更新和多向分化的潜能。
在某些生物因素影响下，或当牙体组织受到创伤和不可逆性的龋病损害时，牙源性干细胞（尤其是DPSC）能分化为新的成牙本质细胞，分泌牙本质基质，进而形成修复性牙本质。在体外特定条件下，培养的牙源性干细胞能分化为成牙本质样细胞，具有高的克隆、增殖和形成致密钙化克隆团甚至是钙化结节的能力，此过程被称为成牙本质向分化。此过程涉及多种转录水平以及转录后水平调控机制。
研究牙源性干细胞成牙本质向分化机制为组织工程和再生医学提供了新思路。非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不编码蛋白质对细胞生命过程起调控作用的RNA，目前研究较多的ncRNA包括了长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA/miR）、环状RNA（circle RNA，circ-RNA）、Piwi-interacting RNA（piRNA）等。其共同点是能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白质，在RNA水平上行使各自的生物学功能。
近年来，关于ncRNA在膀胱、直肠等组织器官的作用机制的研究开展得比较广泛，特别是在癌症的发生和发展方面研究得比较深入。虽然ncRNA在牙源性干细胞中功能和机制的探讨较少，但事实上ncRNA在牙源性干细胞成牙本质向分化作用中发挥了重要作用，其往往通过成牙本质相关基因或相关通路发挥调控作用。
1. lncRNA在牙源性干细胞成牙本质向分化中的作用
lncRNA转录本长度超过200核苷酸（nucleotide，nt），有的甚至超过10 000 nt，数量占ncRNA的80%以上。lncRNA通过与DNA/RNA或者与蛋白质结合，在转录及转录后水平上调节编码蛋白质的基因的表达，改变干细胞多向分化的能力，最终影响细胞的增殖、分化，乃至机体的生长、发育、衰老、死亡等重要生命活动以及疾病的发生和发展。在细胞质中，lncRNA的功能和潜在机制包括：调节信使RNA（messenger RNA，mRNA）的稳定性，调节翻译过程，作为竞争性内源RNA，作为miRNA的前体，调节蛋白质修饰过程。在细胞核中，lncRNA的调节机制包括：作为转录因子等调节蛋白的诱饵，作为RNA蛋白复合物的支架，通过招募染色质修饰因子成为表观遗传调控因子。
1.1 lncRNA在人牙源性干细胞成牙本质向分化中的作用
2012年，Kretz等发现了一种lncRNA，在人外胚层细胞分化时下调，并且需要保持外胚层干细胞或成骨细胞处于未分化的状态，将其命名为反分化非编码RNA（anti differentiation non-protein coding RNA，ANCR），后更名为拮抗分化非编码RNA（differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR）。Zhu等发现，下调的DANCR可通过作用于靶基因果蝇zeste基因增强子同源物2（enhancer of zestehomolog 2，EZH2）以及调控RUNT相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）的表达来促进成骨分化。
Chen等进一步研究发现，上调的DANCR显著降低了糖原合成酶激酶3β的丝氨酸磷酸化（Ser 9 phosphorylation of glycogen synthase kinase 3β，p-GSK-3β）和β-连环蛋白（β-catenin）的表达，提示DANCR可通过抑制Wnt/β-连环蛋白通路的活性进而抑制成牙本质向分化。另外，lncRNA H19是转录自人类染色体11p15.5的H19/lgf2基因族的lncRNA，在细胞核和细胞质中均发挥多种功能活性。
Zeng等研究发现，lncRNA H19可以与S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（S-adenosyl homocysteine hydrolase，SAHH）作用，H19/SAHH途径调控DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase，DNMT）3B介导的同源盒转录因子（distal-less homeobox，DLX）3的基因甲基化和表达，从而在表观遗传水平促进DPSC成牙本质向分化。而Li等发现，lncRNA H19可竞争性结合miR-141，并阻止精子相关抗原（sperm associated antigen，SPAG）9发生miR-141介导的降解，从而提高p38和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N terminal kinase，JNK）磷酸化水平，进而促进人SCAP成骨/成牙本质向分化。
此外，也有学者发现，在缺氧条件下，人DPSC成骨/成牙本质向分化下调；进行ncRNA表达谱生物学分析，结果显示20个lncRNA表达上调，27个lncRNA表达下调；构建lncRNA和mRNA共表达网络，筛选出关键lncRNA 6-12白血病分子（six-twelve leukemia，STL），验证了沉默STL将抑制成骨/成牙本质向分化，并可能通过醌还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶[nicotinamide adenine dinucleotide (NADH): quinone oxidoreductase，NQO]1及内质网氧化还原酶（endoplasmic reticulumoxidoreductin，ERO）1发挥作用。因此，lncRNA在人牙组织来源干细胞分化过程中的调控机制以及调控的多条途径之间的关联可能成为今后的研究热点。
1.2 lncRNA在小鼠牙间充质干细胞成牙本质向分化中的作用
2016年，Zheng等研究了与小鼠牙间充质干细胞成牙本质向分化相关的lncRNA，利用RNA测序比较新鲜分离的与培养的牙髓间充质干细胞的lncRNA表达谱，对差异表达的lncRNA与编码RNA进行共表达分析，发现在新鲜分离的牙髓间充质干细胞中，共有108个lncRNA上调表达，36个lncRNA下调表达。
通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定可知，培养的与新分离的牙髓间充质干细胞相比，在培养的牙髓间充质干细胞中，母系印记基因3（maternally imprinted genes 3，Meg3）、肺癌转移相关转录本1（metastasis-associated lung adeno carcinoma transcript 1，Malat1）、 X（染色体）失活特异性转录物（X inactive specific transcript，Xist）和反义远端同源盒转录因子1（distal-less homeobox 1 antisense，Dlx1as）等与成牙本质向分化相关的基因显著下调，而在具有较强成牙本质向分化潜能的牙源性牙髓间充质组织中表达上调。提示lncRNA失调可能与牙间充质干细胞培养过程中成牙本质向分化潜能的丧失有关。
此外，Dlx1上游生长因子成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）8可诱导牙髓间充质干细胞中Dlx1as的下调和Dlx1的上调，这表明Dlx1as与牙髓间充质干细胞中的Dlx1含量呈负相关，因此Dlx1和Dlx1as的表达可能存在相反的功能表型。
2. miRNA在牙源性干细胞成牙本质向分化中的作用
miRNA是一类广泛存在于真核生物基因组，长度为20~24 nt的内源性非编码蛋白质的单链小分子RNA。在产生miRNA的经典途径中，存在于细胞核中的原始miRNA（pri-miRNA）能被核糖核酸酶Ⅲ Drosha和狄乔治氏综合征相关蛋白8抗体（DiGeorge syndrome-related proteins 8 antibody，DGCR8）识别并裂解为前体miRNA（pre-miRNA），经RNA酶ⅢDicer进一步处理成为成熟miRNA。
研究显示，成熟miRNA通过与靶基因mRNA的3’端非翻译区碱基互补配对结合，导致mRNA降解或者翻译过程受到抑制，从而负调控靶基因的表达。在人类基因组中，大约1 000种miRNA被鉴别出，人类多达30%的基因受miRNA所调节。
2.1 miRNA在人牙源性干细胞成牙本质向分化中的作用
近年已有研究表明部分miRNA可促进人牙源性干细胞成牙本质向分化。Xu等研究在低浓度肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α介导下，miR-21和信号转导与转录激活因子（transducer and activator of transcription，STAT）3表达上调，上调的miR-21协同STAT3来调控人DPSC成牙本质向分化，构成miR-21/STAT3信号通路。也有研究发现，miR-223-3p与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）4发生解离，从而抑制转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β信号通路的细胞内效应器Smad3，进而促进人DPSC成牙本质向分化。此外，部分miRNA在牙源性干细胞成牙本质向分化过程中表达下调。有学者研究miR-143-5p抑制成牙本质向分化的相关机制。
Wang等发现，下调的miR-143-5p可降低与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）14的结合，促进MAPK14表达，激活p38 MAPK信号通路以促进成牙本质向分化。Zhang等探究miR-143-5p在人DPSC成牙本质向分化中通过骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）/核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）信号通路直接作用于RUNX2的机制。
双荧光酶素报告显示，RUNX2是miR-143-5p的直接作用靶基因；进一步实验显示，在转染了pMIR-miR-143-5p抑制体质粒的人DPSC中，碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表达活力增强，钙化结节形成增多，牙本质磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）、牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）、牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）1、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨唾液酸蛋白（bonesialoprotein，BSP）、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、RUNX2和OPG表达上调，而RANKL表达下调，细胞侵袭迁移能力以及黏附能力增强，提示下调的miR-143-5p通过OPG/RANKL信号通路上调RUNX2的表达，进而促进人DPSC成牙本质向分化。
此外，在IGF1处理的人SCAP中，hsa-let-7c可通过胰岛素样生长因子（insulin like growth factor，IGF）-1/胰岛素样生长因子-1受体（insulin like growth factor-1 receptor，IGF-1R）/hsa-let-7c轴，抑制JNK和p38 MAPK信号通路，进而抑制成牙本质向分化。
2.2 miRNA在小鼠牙间充质干细胞成牙本质向分化中的作用
在小鼠模型中，Li等发现miR-3065-5p在成牙本质向分化过程中上调。双荧光酶素报告显示，miR-3065-5p与骨形态发生蛋白受体Ⅱ型（bone morphogenetic protein receptor type Ⅱ，BMPR2）的3’端相结合，BMPR2在成牙本质向分化早期表达增多，而在晚期则表达剧烈下降。由此证实了小鼠模型中miR-3065-5p可部分通过BMPR2调控成牙本质向分化。
3. circRNA在牙源性干细胞成牙本质向分化中的作用
circRNA是一类特殊的ncRNA分子，大量存在于真核细胞中，是由前体mRNA通过特殊的选择性剪切产生的，与传统线型RNA不同，呈封闭环状结构，不易被核酸外切酶RNaseR降解，比线性RNA更稳定，因此成为新的生物学标记物。目前关于circRNA在人DPSC成牙本质向分化中的功能及机制的探讨较少，尚停留在小鼠模型上，且多以基因芯片和生物信息学分析为主，但伴随着新的研究技术体系的建立，circRNA在人DPSC成牙本质向分化中的机制将进一步得以阐明。
占云燕等对小鼠牙乳头细胞向成牙本质细胞分化过程中的circRNA的表达谱进行了研究，发现在经矿化诱导的牙乳头细胞中，差异表达的circRNA共4 064条，其中3 255条上调表达，809条下调表达。分析其中上调circRNA来源基因，发现很多基因与牙的发育过程及硬组织矿化相关。
4. ncRNA在牙源性干细胞成牙本质向分化中的研究展望
综上所述，牙源性干细胞的成牙本质向分化会受到多种ncRNA的调控，兼有抑制或促进效应，其机制既包括直接作用于成牙本质向分化相关转录因子，也有间接作用于转录因子相关因素，甚至构成反馈环路发挥调控作用。lncRNA、miRNA和circRNA关系密切，它们彼此相互作用，在人体内构成一个复杂而精准的网络调控体系。近年来关于内源性竞争RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）的作用机制探讨较多，lncRNA和circRNA甚至某些miRNA均可发挥miRNA分子海绵作用，调控宿主基因表达。
笔者认为，关于ncRNA对成牙本质向分化的相关调控因素作用方面的研究，不仅有助于深入探究ncRNA这一参与许多重要生命活动的调控因子，也将有利于为牙源性干细胞的再生治疗提供新的思路和方法。另外，关于寻找ncRNA结构和功能的更高效的研究方法，也将会成为ncRNA今后的研究热点和重点。
