外泌体是由细胞经“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成的双层膜性脂质小囊泡。外泌体最初被认为是细胞处理废物的一种手段，随后研究者对其生物学特性及作用的不断研究发现，外泌体在细胞生理及病理过程中扮演重要角色，尤其在细胞间信号转导、组织损伤修复、炎症反应、免疫调节及肿瘤生长调控等方面具有重要作用。
外泌体能被多种细胞分泌，包括上皮细胞、肥大细胞、树突状细胞、T淋巴细胞、间充质干细胞等。与其他类型的细胞相比，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）能产生更丰富的外泌体，其分泌的外泌体形态结构与其他细胞来源的外泌体无明显差异，MSCs外泌体还保留了与MSCs相似的生物学特性及功能，具有比MSCs更稳定和易于保存的优点。
牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）是存在于牙髓组织具有高度增殖能力及多向分化潜能的未分化MSCs，具有无伦理争议、易于获取、安全性高等优点，在牙髓再生中具有重要作用。与其他MSCs分泌的外泌体类似，DPSCs分泌的外泌体保留了与其来源DPSCs相似的生物学特性及功能。因此，MSCs分泌的外泌体，尤其是DPSCs外泌体具有巨大的潜在应用价值。
1.外泌体概述
外泌体是一种直径约为30～150nm，密度约为1.11～1.19g/mL的多囊泡体，具有动态亚细胞结构，其形态为双凹碟状或杯状，而在人体体液中呈球状。外泌体具有典型的脂质双分子层膜结构，质膜中含有胆固醇、脂筏、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸、神经酰胺等，可保护囊泡内物质免受降解。此外，质膜决定了外泌体的趋向性，其表面或内部的特异性蛋白分子在胞间信号传递中具有重要作用。
囊泡内含有与其来源细胞类似的脂质、蛋白质（如各种细胞因子）及核酸（如mRNA、microRNA）等，可以分泌到细胞外并与靶细胞进行细胞间通讯，调节自身或其他细胞的功能。
1.1外泌体的合成及分泌
外泌体由细胞膜内吞形成内体，再向细胞内出芽形成微囊泡，其合成过程复杂而连续，一般分3个阶段：第一阶段是细胞发生内吞，细胞膜向内凹陷形成早期胞内体；第二阶段是早期胞内体成熟为晚期胞内体，早期胞内体再次向内凹陷并脱落形成大量的内囊泡，这种含有许多囊泡的胞内体即为多囊泡胞内体，多囊泡胞内体的形成依赖于两种机制：一种是内吞体分选转运复合体（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）机制，另一种是非依赖性ESCRT机制；第三阶段是多囊泡胞内体与质膜融合，内囊泡被释放到细胞外，形成外泌体或者与溶酶体融合，内容物被降解。
外泌体分泌后一般通过以下3种方式与靶细胞进行细胞间通讯：①被远距离的细胞捕获并摄入；②被邻近的细胞或分泌外泌体的细胞捕获并摄入；③进入循环系统并被其他组织摄入。
1.2外泌体的提取及鉴定方法
目前外泌体的提取方法有超速离心法、超滤法、免疫磁珠法、排阻色谱法、聚乙二醇沉淀法、微流控芯片技术等。上述分离方法各有优缺点，其中超速离心法因具有能处理大量样本和成本低等优点成为最常用的方法，但各种分离方法都不能将外泌体与其他细胞外囊泡亚群完全分离，因而目前尚无统一的“金标准”。外泌体的鉴定需要从形态、粒径大小及蛋白分子标记等方面进行。
中国抗癌协会肿瘤标志专业委员会外泌体技术专家委员会撰写的《外泌体研究转化和临床应用的专家共识》指出，外泌体可通过下列方法进行分析：外泌体形貌分析；外泌体群体粒径分析；外泌体蛋白质分析；RNA分析；DNA分析；代谢分析。外泌体的成熟经历了内体、内囊泡及多囊泡胞内体等阶段而不断失去和获取不同的蛋白质，因此外泌体尚无明确的特异性标记物，但任何一种来源的外泌体都会表达若干标志性蛋白分子。
国际细胞外囊泡学会规定至少需要检测外泌体表面蛋白CD63及外泌体内蛋白肿瘤易感基因101蛋白，CD63是常用的外泌体标记物，为研究非依赖性ESCRT的多囊泡胞内体所需，而肿瘤易感基因101蛋白参与了ESCRT依赖性外泌体形成，目前也被用来作为外泌体的标记物。此外，外泌体包含大量的细胞代谢产物，包括脂质、糖、氨基酸等小分子，因此，通过分析外泌体代谢产物的变化可了解来源细胞的生化状态。目前使用提取方法所获得的外泌体的数量及纯度都比较低，且无快速鉴定外泌体的技术，因而外泌体的研究与应用受到限制。
2.间充质干细胞外泌体的生物学功能
MSCs通过内分泌和（或）旁分泌作用与不同类型的靶细胞进行细胞间通讯，广泛参与细胞生物学活动的调控。根据目前的研究，MSCs外泌体的生物学功能主要包括：
2.1促进组织修复再生
MSCs外泌体内所含的RNA或蛋白质通过调控靶细胞内相关基因表达，促进生长因子分泌，使靶细胞增殖、迁移或定向分化，促进神经或血管新生，最终达到恢复受损组织功能的目的。
2.2调节免疫
损伤组织修复过程中往往伴随着炎症反应，而巨噬细胞在其中扮演重要作用。巨噬细胞分为M1型和M2型，M1型巨噬细胞以发挥促炎功能为主，M2型巨噬细胞以发挥组织修复功能及抗炎为主。MSCs外泌体一方面诱导巨噬细胞向M2型极化，促进单核巨噬细胞分泌转化生长因子-β、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）等抗炎性细胞因子，另一方面抑制T细胞激活、分化、增殖并诱导T细胞向抗炎型分化，同时抑制干扰素γ、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β等促炎症细胞因子产生，减轻炎症反应。
2.3减少细胞凋亡
MSCs外泌体能上调靶细胞内生长因子及其下游B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）等抗凋亡蛋白的表达，阻止靶细胞凋亡。
2.4缓解氧化应激状态
MSCs外泌体能显著降低中性粒细胞的比例，减少中性粒细胞的聚集，同时增加ATP含量，改善细胞的存活，抑制缺血再灌注损伤后血管的不良重塑。某些MSCs（如人脐带MSCs）外泌体中还含有谷胱甘肽过氧化物酶1，能显著减轻组织损伤。
2.5调节胶原合成
有研究表明，外泌体可以迁移至组织创伤部位并被组织中的成纤维细胞吸收，在创口愈合早期促进I、Ⅲ型胶原合成，而在晚期则抑制胶原合成，最终促进皮肤创口愈合。
2.6调控肿瘤生长
MSCs外泌体通过介导细胞间相互作用修饰细胞表型，肿瘤细胞通过内化MSCs外泌体改变细胞功能，影响肿瘤微环境，使肿瘤细胞获得新的特性。此前多项研究表明，MSCs外泌体能促进或抑制肿瘤的生长，目前人们普遍接受Roccaro等提出的观点，即MSCs外泌体对肿瘤的调控作用取决于肿瘤的类型及状态。了解这些机制对应用MSCs外泌体治疗相关疾病具有指导意义。
3.牙髓干细胞外泌体
在口腔再生医学领域，牙源性MSCs是最重要的一类MSCs，具有比骨髓MSCs更强的诱导成神经、成脂、成骨组织等能力和更强的多向分化潜能。DPSCs是最先被发现的牙源性MSCs。多项研究表明，DPSCs外泌体与牙髓再生、炎症反应、神经退行性疾病、肿瘤等方面关系密切，因此牙髓干细胞外泌体具有巨大的潜在应用价值。
3.1DPSCs外泌体与牙髓再生
牙髓再生是借助生物学手段，采用组织工程原理实现受损牙髓以及根尖周组织的再生与修复，继续使牙髓发挥形成、营养、感觉、防御的功能。目前牙髓再生面临的问题主要包括成牙本质细胞再生、牙髓血运重建及支架移植等。DPSCs是用于牙髓再生的重要种子细胞，DP-SCs外泌体在牙髓再生方面的应用也成为研究热点。Dissanayaka等将DPSCs和人脐静脉内皮细胞置于可注射多肽水凝胶中进行共培养，发现DP-SCs通过细胞间相互作用促进人脐静脉内皮细胞迁移和血管内皮生长因子的表达，最终形成早期血管网络。
柳鑫等在Dissanayaka的实验基础上探究DPSCs增强内皮细胞血管形成能力的具体机制，发现人DPSCs通过分泌外泌体增强内皮细胞增殖和迁移能力，其效果呈浓度依赖性。除增强内皮细胞的血管形成能力外，DPSCs外泌体还可诱导MSCs成牙本质向分化。Huang等分别从DPSCs生长培养基和成牙本质向分化培养基中提取外泌体，加入到I型胶原膜上并植入DPSCs，结果发现DPSCs外泌体可与I型胶原、纤维连接蛋白等基质蛋白结合并连接到生物材料上；DPSCs和人间充质基质细胞通过P38丝裂原活化蛋白激酶通路介导的内吞作用，以饱和方式和剂量依赖性吞噬外泌体；将I型胶原膜放入人牙根切片根管进行体内培养，结果显示牙根切片模型内有牙髓样组织再生。
进一步研究发现DPSCs外泌体能上调DPSCs内牙本质涎磷蛋白基因、生长因子（骨形态发生蛋白9）、转录因子（Runx2和Osterix）及细胞外基质蛋白（碱性磷酸酶和I型胶原）的表达，促进MSCs的成牙本质向分化这些研究为牙髓再生提供了新思路。
3.2DPSCs外泌体的抗炎作用
鉴于MSCs及其外泌体在免疫调节方面取得的进展，研究人员对DPSCs外泌体在炎症反应中的作用展开了积极探索。糖皮质激素是临床常用的抗炎药物，然而糖皮质激素有血糖升高、高血压、精神改变、胃溃疡等诸多不良反应，因此科学家们致力于寻找一种更理想的抗炎药物。Pivorait等发现脱落乳牙牙髓干细胞（stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED）外泌体能显著缓解人工诱发的小鼠急性炎症，并减轻组织水肿。体内实验观察到急性炎症部位的基质金属蛋白酶及组织蛋白酶B的活性受到抑制。糖皮质激素抗炎机制与环氧合酶-2及磷脂酶A2的产生有关，而增加膜联蛋白A1的合成可抑制磷脂酶A2通路。
蛋白组学研究表明SHED外泌体中含有膜联蛋白A1，因此推测SHED外泌体通过将膜联蛋白A1转运至炎症组织发挥抗炎作用。此外有研究表明，DPSCs外泌体通过调节损伤组织中巨噬细胞M1/M2极化发挥与MSCs外泌体类似的损伤修复作用。苏晓磊等利用脂多糖诱导大鼠急性肺损伤，并分别用脂多糖和脂多糖联合DPSCs外泌体处理损伤肺泡巨噬细胞，结果显示经过高剂量DPSCs外泌体处理后的大鼠肺泡巨噬细胞内TNF-α、IL-1β和IL-6等M1型极化相关因子表达下降。DPSCs外泌体能降低转录因子核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）（p65）、IκBα以及p44/42的磷酸化水平，提示外泌体对损伤肺组织的保护作用可能与抑制丝裂原活化蛋白激酶和NF-κB信号通路有关。
小胶质细胞是存在于大脑中的巨噬细胞，在神经炎症性疾病中发挥免疫作用。Li等研究表明，SHED通过分泌外泌体减少小胶质细胞内炎症因子的分泌，同时SHED外泌体可通过改变小胶质细胞M1/M2的极性缓解神经炎症反应，这为治疗创伤性颅脑损伤等神经炎症疾病提供了新方法。
3.3DPSCs外泌体治疗神经退行性疾病
神经退行性疾病是由于脊髓和大脑的神经元和（或）髓鞘丧失所致的疾病状态，病理变化多表现为神经变性。目前神经退行性疾病发病机制尚不明确，可能与氧化应激、炎症和（或）免疫反应、细胞凋亡、线粒体功能紊乱及兴奋性毒性有关。MSCs外泌体具有显著的抗细胞凋亡和抗细胞坏死作用，可通过激活磷脂酰肌醇3-激酶-Bcl-2通路阻止细胞凋亡，并通过促进宿主内源性神经生长因子的分泌保护神经元。
DPSCs来源于神经嵴外胚层，具有神经趋向性，而外泌体具有易穿透血脑屏障、保护神经及促进神经修复再生的特点，因此研究人员设想应用DPSCs外泌体治疗神经退行性疾病。Venugopal等在体外应用红藻氨酸诱导兴奋毒性，有研究发现人DPSCs外泌体比人骨髓MSCs外泌体能更好地防止神经细胞凋亡，其抗凋亡机制可能与内源性抗凋亡因子Bcl-2有关。
Jarmala-viciute等利用6-羟基多巴胺处理多巴胺能神经元，用海藻酸钠微载体作为生物反应器培养SHED并纯化、提取外泌体。结果显示海藻酸钠微载体培养的SHED外泌体可减少大约80%的多巴胺能神经元凋亡。这为应用SHED外泌体治疗帕金森病等神经退行性疾病提供了理论依据。然而上述实验仅在体外进行，体内实验的效果尚未得到验证，DPSCs外泌体内容物对神经保护的作用机制也需进一步研究。
3.4DPSCs外泌体作为治疗肿瘤的药物载体
DPSCs外泌体可作为某些基因或药物的载体发挥抗肿瘤作用。Altaner等利用酵母尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（yeast cytosinedeaminase：：uracilphos phoribosyl transferase，yCD：：UPRT）基因修饰的MSCs外泌体处理肿瘤细胞，在前体药物5-氟胞嘧啶的作用下，肿瘤细胞将5-氟胞嘧啶转变为5-氟尿嘧啶，后者转化为5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸，阻止DNA合成，促进肿瘤凋亡。
Altanerova等从鼻内植入氧化铁纳米颗粒（Venofer）标记的DPSCs后观察到DPSCs迁移并定植于鼠颅内胶质母细胞瘤内，释放含有氧化铁纳米颗粒的外泌体。经yCD：：UPRT转导的DPSCs外泌体能够被肿瘤细胞以剂量依赖性方式有效地内吞，通过yCD：：UPRT/5-氟胞嘧啶途径诱导肿瘤细胞凋亡。此外，含有氧化铁纳米颗粒的肿瘤细胞能被交变磁场通过热疗方式消融。因此，氧化铁纳米颗粒标记的载有抗肿瘤基因转导mRNA的外泌体有望成为新一代肿瘤治疗药物。
4.小结
传统的干细胞疗法具有一定的风险，如移植细胞引起的免疫排斥、干细胞遗传物质变异、促进肿瘤转移、血管栓塞以及过度放大疗效等问题，而外泌体则无上述风险，因此干细胞来源的外泌体有望成为组织损伤修复治疗的新方法。MSCs是具有自我更新能力的多能干细胞，具有多向分化潜能，是目前最具应用前景的干细胞之一，而MSCs外泌体能模拟MSCs的生物学功能，近来逐渐被证实能促进组织修复和治疗某些难治性疾病。
DPSCs外泌体具有与其他MSCs外泌体相似的组成和生物学功能，且与其他MSCs外泌体相比具有更多的优势。这些优势主要体现在外泌体来源细胞方面，如DPSCs获取途径简单、增殖能力强、具有神经趋向性等。然而有关DPSCs外泌体的研究甚少，其临床应用仍处于动物实验阶段。目前存在以下问题：①DPSCs外泌体提取及鉴定无统一的“金标准”；②对DPSCs外泌体内容物及具体分子机制尚未完全明确；③DPSCs外泌体的研究目前局限在牙髓再生、炎症控制、神经系统疾病以及肿瘤靶向治疗方面，在其他领域如骨和神经等组织修复及心血管疾病治疗等方面的研究仍需进一步探索。
