牙髓干细胞对面神经损伤修复研究进展

    1.面神经损伤的修复与再生
    面神经是人体居于骨管中最长的周围神经，因面神经覆盖范围广泛，解剖结构独特，加之其位置特殊，因此颅面部的损伤常可伴发面神经损伤，这也造成面神经损伤发生率居高不下。当损伤未得到及时修复，亦或修复方式不恰当而导致神经功能恢复欠佳时，都会引起损伤神经支配的效应肌群的废用，出现不同程度的面瘫表现，严重影响患者的身心健康。
    1.1 面神经的解剖
    面神经走行迂曲，分支众多，神经管段神经穿出茎乳孔出颅后，进入腮腺的后内侧表面，形成颞支、颧支、颊支、下颌缘支以及颈支5个末端分支。由于神经管内骨性结构及特殊的颅面解剖位置，且其终末分支于面部的表浅走行，导致如颞骨骨折、面颈部开放性创伤等诸多颅面颈部的外伤常常伴发面神经的损伤。同时，因面神经解剖位置邻近腮腺、中耳等重要结构，口腔颌面外科和耳鼻咽喉头颈外科的某些手术中也容易对其分支及神经管段神经造成医源性损伤。
    1.2 目前面神经损伤的修复方法
    1.2.1 神经松解术
    当因创伤等原因造成腮腺区软组织挫伤、水肿或神经管出现不同程度的断裂、形变时，均压迫面神经，此时面神经可能发生麻痹。对于保守治疗无效的患者，有学者认为以2个月以内时间为节点，进行面神经探查及松解手术是治疗疾病的有效手段。通过面神经减压术，松解神经受压区域，剥离神经组织粘连区，或解除管腔内压力，消除神经水肿，减轻压迫症状，促进神经功能恢复。结合使用神经营养药物支持，当非变性神经纤维呈富血供状态且从受压阻滞状态恢复神经传导功能后，面瘫症状可明显减轻或完全消失。此种情况应为患者面神经并未发生离断或完全变性，外科干预及时有效时，因神经保留完整的结构，随着水肿的消除，功能恢复，预后往往较好。
    1.2.2 神经吻合术
    当面神经发生损伤时，最佳修复方法为直接神经断端缝合，其中最常用和最有效的术式便是端端吻合术，即将神经一端直接修复到另一端，是指神经发生了离断，但是没有发生缺损，或者缺损后离断的距离小于2cm时，在显微镜下可无张力或在适当张力下直接缝合神经的两个断端，使神经轴突达到最大限度的对齐，这样能够较大程度提高远端神经的质量，促进靶器官功能的恢复。
    当缺损大于2cm 时，由于张力过大导致缝合困难，术后易发生瘢痕收缩，端-端吻合术效果并不理想。神经延长吻合适用于这种面神经缺损较短，但又不宜行直接吻合术的面神经损伤，具有较好疗效。侧端吻合是指不需移植，直接将面神经断端吻合到其邻近的一些神经上，此方法可一定程度恢复患侧面部肌肉的神经支配，但是由于神经纤维之间的混合桥接，术后会产生连带运动的不良反应。
    1.2.3 神经移植
    当面神经缺损过多导致无法行端-端吻合时，通常采用神经移植术。神经移植术通常采用自体远处的一段神经作为移植物，来桥接离断较长的面神经断端。自体神经移植不易产生免疫排斥反应，而且自体神经本身含有较多的神经营养因子，从而构成了有助于神经再生的微环境。
    耳大神经、股内侧皮神经前支等均属于自体神经，其中效果最好的是自体耳大神经的移植。“剜肉补疮”式的自体神经移植虽能获得较好的术后恢复效果，是目前临床治疗面神经缺损的“金标准”，但仍然存在很多局限性，如供体神经来源有限、供体神经支配区神经功能障碍，以及供区麻木、瘫痕、神经瘤等并发症。因此，寻找一种能代替自体神经移植的有效方法，一直是面神经损伤修复的研究热点。
    1.2.4 神经组织工程
    近些年，利用干细胞来治疗神经损伤受到广泛关注，干细胞由于具有多种优势，为神经损伤的治疗提供了新的思路。干细胞可以促进神经再生的主要作用包括以下几个方面：第一，干细胞可以分泌多种抗炎因子和神经营养因子，移植于神经损伤区后，这些分泌的因子有助于神经损伤的恢复；第二，雪旺细胞是神经髓鞘的组成部分之一，能够促进神经受损区的多种组织类型的修复，但是其数量不足，来源有限，干细胞可以分化为雪旺细胞，补充雪旺细胞的不足；第三，干细胞亦可以作为神经元的替代细胞。面神经损伤的早期，伴随着大量的神经元损伤与死亡，干细胞在合适的外环境下可以分化为神经元样细胞，以补充受损的神经元，促进神经的再生。
    导管支架在面神经损伤的组织工程修复中发挥重要作用，不但具有一定的机械强度，为神经再生提供空间，而且具有较好的生物相容性，有利于细胞的粘附、增殖等。神经导管主要分为生物型、人工合成型以及复合型3种。其中自体静脉和骨骼肌是常用的生物型神经导管。硅胶管是目前最常应用的人工合成型导管，多孔丝素导管、聚四氟乙烯平板和胶原导管也用于面神经损伤的修复。复合组织导管可以满足受损组织或器官的神经再生需求，以完成受损组织或器官功能的恢复或重建。研究发现，神经干细胞-透明质酸支架复合神经营养素对于兔面神经损伤具有良好的修复效果。
    2.牙髓干细胞在神经损伤修复中的研究现状
    2.1 牙髓干细胞在神经修复中的潜在优势
    牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）是2000年Gronthos等首先从成人的牙髓组织中分离培养获得，具有自我更新、高度增殖以及多向分化潜能。DPSCs来源充足，可从拔除的正畸牙和第三磨牙中提取出来，可有效利用医疗废物，获取途径简单，不涉及伦理道德问题，且不会对人体额外损伤，进而减少感染的风险。此外，DPSCs免疫原性低，也不存在诱导性多能干细胞相关的安全性问题。
    更重要的是，DPSCs的组织胚胎学来源于神经嵴结构，因此与大多数其他成体干细胞相比，具有更高的神经源性潜能。研究发现，在来自单一供体的牙髓、牙囊以及牙乳头3种类型的间充质干细胞中，牙髓来源的间充质干细胞具有更高的神经源性潜能。与骨髓间充质干细胞以及脂肪干细胞相比，DPSCs对视神经的再生修复具有更大的潜能。
    研究证实，DPSCs表达成熟神经元标记物以及神经干细胞标记物，并证明其具有固有神经胶质细胞特征。而且，DPSCs在培养基中分泌的神经营养因子的含量显著骨高于骨髓间充质干细胞。综上所述，DPSCs是治疗神经损伤的理想干细胞，具有良好应用前景。
    2.2 DPSCs治疗中枢神经损伤的研究
    脊髓损伤、中风、阿尔茨海默病和帕金森病是常见的中枢神经系统疾病。中枢神经系统通常具有较差的修复和再生能力。目前，用常规临床疗法治疗中枢神经系统疾病是非常困难的。研究发现，干细胞治疗可能是一种治疗中枢神经系统疾病新策略。
    脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）会使神经元丧失，在损伤的相应区域出现感觉、运动的异常，严重者会导致损伤节段以下的肢体严重功能障碍。DPSCs已经成为SCI治疗的首选干细胞，这得益于DPSCs可分化为神经元样和少突胶质细胞样细胞，从而促进脊髓损伤后的轴突再生和组织修复。
    Yang等将大鼠脊髓完全切断，构建大鼠SCI模型，将DPSCs植入脊髓缺损断端，结果表明，DPSCs能够减轻炎症、减少进展性出血性坏死反应、促进轴突再生，并且部分DPSCs可分化为成熟神经元和少突胶质细胞，促进神经再生。应用DPSCs与壳聚糖支架共同移植时，DPSCs通过分泌多种因子，促进运动功能恢复，抑制脊髓损伤后细胞凋亡。
    中风是一种缺血性脑血管疾病，会导致脑损伤，长期残疾，甚至死亡。由于干细胞的多能性，免疫调节和神经保护以及血管生成特性，干细胞治疗可能为中风治疗提供一种新策略。研究发现，DPSCs移植到SD大鼠的大脑中动脉闭塞缺血区域可促进运动功能恢复，并通过分化为多巴胺能神经元和分泌神经营养因子来减少梗死面积。
    DPSCs移植到大鼠局灶性脑缺血的缺血区域促进促血管生成因子的表达，这些因子促进致密的毛细血管形成和血流的重新定位。在啮齿动物模型中，将DPSCs移植到局灶性脑缺血区域4周，可促进前肢感觉和运动功能恢复。DPSCs还通过减少反应性胶质瘤和预防体外缺血模型中的自由基和IL-1β的分泌，为星形胶质细胞提供保护。因此，DPSCs可以发挥多种作用促进缺血性中风后的功能恢复。
    阿尔海默兹症（Alzheimer's disease，AD），即老年痴呆症，是一种以大脑皮层萎缩、皮质神经元损伤以β淀粉样蛋白堆积形成等为主要特征的神经退行性病变。Wang等用冈田酸可诱导人神经母细胞瘤细胞形成AD模型细胞，将其与DPSCs在Transwell小室共培养后，发现AD模型细胞的形态得到明显改善，细胞存活率也显著提高，且促进神经元修复和再生。因此，DPSCs有望在治疗AD中发挥重要作用。
    帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种进行性神经退行性疾病，与黑质纹状体多巴胺能神经元的丧失相关，会导致肌肉僵硬、运动迟缓、静止性震颤和姿势不稳。作为PD治疗的新策略，干细胞疗法具有良好前景。通过使用特定细胞诱导培养基，可以诱导DPSCs在体外分化为神经元样细胞。
    研究表明，对PD模型小鼠进行脊髓穿刺，将DPSCs递送到脑脊液中进行观察，12周后发现鞘内移植DPSCs可促进小鼠行为缺陷的恢复，并且可以恢复多巴胺能神经元功能。DPSCs在PD的体外模型中也显示出神经免疫调节活性。DPSCs还可促进多巴胺能神经元的存活并增强PD大鼠模型中的黑质纹状体功能恢复。因此，DPSC的临床应用可能为未来治疗PD带来新的希望。
    2.3 DPSCs治疗周围神经损伤的研究
    由创伤性事故和医源性损伤引起的周围神经损伤通常伴随身体残疾和神经性疼痛。目前有许多临床治疗方法，其中自体神经移植是周围神经缺损治疗的金标准，但仍存在许多局限性。随着神经组织工程和干细胞相关治疗的发展，各种新型神经导管与干细胞相结合，为治疗周围神经损伤提供了替代策略和方法。DPSCs具有分化为雪旺样细胞和少突胶质细胞样细胞的能力，并且它们可以分泌神经营养因子，提供神经保护并调节免疫应答，未来有望成为外周神经损伤治疗有前景的细胞来源。
    坐骨神经损伤模型是一种经典模型，通常用于研究周围神经损伤。研究表明，DPSCs可以在体外分化为雪旺细胞，将这些分化的DPSCs移植到15mm大鼠坐骨神经缺损部位后，免疫组化结果显示形成有髓的神经纤维和向内生长的神经突。研究发现，STRO-1+/c-Kit+/CD34+ DPSCs可以分化为雪旺细胞前体并分泌包括NT-3和BDNF在内的神经营养因子，从而促进坐骨神经损伤模型中的周围神经再生和髓鞘再生。
    此外，少突胶质细胞谱系转录因子2基因的上调可诱导DPSCs分化为功能性少突胶质细胞，在坐骨神经损伤中显示出治疗潜力。DPSCs与不同支架类型相结合的能力，有助于在不同的坐骨神经损伤动物模型中促进周围神经再生并恢复功能。研究发现，在大鼠坐骨神经损伤模型中，使用DPSCs注射的胶原蛋白支架可促进髓鞘形成和轴突再生以及功能恢复；体外实验的数据显示，DPSCs可分泌大量的神经营养因子，在周围神经再生中起关键的神经保护作用。这些发现证实DPSCs在坐骨神经损伤动物模型中直接或通过旁分泌机制促进轴突再生的能力。
    Omi等发现注射DPSCs能够改善受损的坐骨神经血流量，增加坐骨运动感觉神经的传导速度，并增加毛细血管对肌肉和表皮内神经纤维的供给。切除大鼠坐骨神经5cm，采用可降解胶原管桥接神经断端，对照组胶原管中不含细胞，实验组胶原管管腔中含有DPSCs，结果发现实验组产生神经营养和血管生成因子，增强神经再生的长度，促进轴突的再生。由此说明DPSCs可能通过在神经损伤处附近分泌神经营养因子以及血管生成因子，调节雪旺细胞的凋亡和增殖，进而促进周围神经的再生。
    2.4 应用DPSCs修复神经可能的生物学机制
    DPSCs作为细胞治疗的全新来源，参与多种神经修复，但目前DPSCs在神经修复中的作用机制尚未完全明确，涉及多个方面。首先，DPSCs可以直接分化为神经样细胞，阳性表达包括Nestin在内的早期神经标志物，而且从牙齿组织中可以分离出可直接分化为神经谱系的亚群。
    这些细胞迁移到病变部位以替换坏死组织。其次，DPSCs通过发挥旁分泌作用参与神经修复。DPSCs 表达BDNF、GDNF、NGF和NT-3等多种神经营养因子。而且，在神经诱导条件下，DPSCs的神经营养因子表达显著增加。DPSCs的条件培养液可以提高雪旺细胞的生长速率，并在体外诱导神经突生长。第三，DPSCs通过抑制细胞凋亡来改善神经修复。细胞凋亡是SCI和AD疾病模型中神经元损伤的主要原因。在SCI模型中，转染的DPSCs可抑制早期神经元凋亡。
    在AD模型中，DPSC可以降低冈田酸诱导的神经母细胞瘤细胞的凋亡水平。研究发现，DPSCs可以分泌包括Bcl-2在内的凋亡抑制蛋白，并降低凋亡调节因子Bas的表达，这些作用都有助于下调神经细胞对凋亡信号的反应。
    第四，DPSCs通过免疫调节促进神经修复。DPSCs可以抑制TNF-α的释放，上调抗炎细胞因子的表达，最终促进神经修复。最后，血管新生对于神经再生至关重要，研究发现DPSCs可能通过促进血管内皮大量分泌表达血管内皮生长因子，促进血管再生，从而促进轴突生长以及诱导雪旺细胞增殖。此外，控制突触形成的CXCR4/SDF1-α途径与缺血状态下移植的DPSCs有关。大量实验证实移植的DPSCs促进了神经系统损伤模型的功能恢复，但确切机制尚未完全明确，因此DPSCs修复神经的潜在机制仍需进一步研究。
    3.牙髓干细胞在面神经损伤修复中的应用前景
    DPSCs具有多向分化潜能，来源充足，较易获取，免疫原性低，在伦理学及免疫排斥等方面均具有明显的优越性，与面神经邻近且组织胚胎学均来源于神经嵴结构，具有更高的神经源性潜能。因此，基于DPSCs的疗法在面神经损伤的修复治疗中显示出巨大的优势。已有许多实验证实移植的DPSCs促进面神经损伤模型的功能恢复。应用含有DPSCs的硅胶管来修复面神经病变的实验证明DPSCs可以在功能和电生理方面促进面神经再生。利用大鼠DPSCs联合Ⅰ型胶原凝胶的硅胶管植入修复面神经缺损的动物实验发现，2周后形成轴突、髓鞘等神经细胞标志性结构。
    充满DPSCs的聚乙醇酸（PLGA）管可以促进受伤的面神经恢复和再生。有研究通过手术离断兔面神经上颊支，建立兔面神经损伤模型，向缺损处注入DPSCs悬液，与不加细胞的对照组相比，实验组再生神经纤维的数目、直径以及髓鞘的厚度均显著提高，且缺损处的BDNF与CNTF的表达均上调。尽管DPSCs能够分化为类似于神经元、雪旺细胞和少突胶质细胞等细胞，但它们在神经退行性疾病和损伤修复中发挥的有益作用主要是由于其分泌一些神经营养因子，其确切机制仍未完全明确。
    DPSCs与生物材料的结合为面神经修复提供了良好方向。在神经再生和修复实验中最常使用的生物材料是壳聚糖、PCL/PLGA、硅胶管和电纺神经支持支架，然而，尚未有一种材料满足面神经修复所需的所有条件。同时，DPSCs如何调节面神经修复的机制尚未完全明确，是DPSCs转化为神经细胞，补充了损失掉的神经细胞，还是通过分泌各种因子和基质等优化了局部环境，动员了周围神经细胞的增殖和分化，从而促进损伤的修复，这些都需要进一步研究探索。DPSCs应用于面神经损伤修复具有良好的应用前景，但将其真正应用于临床仍任重道远，需要不断研究和深入挖掘。