组织工程技术应用于牙周膜再生研究进展

2016-12-27 15:12 来源:中国实用口腔科杂志
作者:夏商 姜力铭 陈旭

    组织工程技术主要包括种子细胞、支架材料和生长因子三要素,其基本原理是将种子细胞在体外进行培养扩增,将其与具有良好生物相容性、可降解吸收性的支架材料按一定的比例混合形成细胞一材料复合物,将其植入机体的组织或器官病损部位,最终形成相应的组织或器官,从而达到修复创伤和重建功能的目的。本文就近年来牙周膜再生治疗中组织工程技术的研究及应用进展做一综述。

    1支架材料

    支架材料的作用类似于细胞外基质,可以模拟细胞黏附、增殖、分化以及形成新组织的微环境,并且当支架材料中负载药物时,具有高效的负载率和持续长久的释放率陋]。理想的支架材料需具备良好的生物相容性、生物降解性、机械稳定性,还需要有较高的孔隙率。用于组织再生的支架材料范围广泛,主要有天然衍生材料、人工合成材料、复合支架材料3大类。

    1.1天然衍生材料

    天然衍生材料包括胶原蛋白、壳聚糖、海藻酸盐、纤维蛋白等,这类材料具有良好的生物相容性,无明显毒副反应和抗原性,降解之后可被机体吸收代谢;缺点是机械强度低,力学和加工性能差。明胶由胶原降解而获得,因具有非抗原性、可吸收性、成本低等优势广泛应用于临床。

    将牙周膜细胞(periodontal ligament cells,PDLCs)接种于利用静电纺丝法制作的明胶薄膜表面发现,48 h后细胞可以实现良好的黏附和生长,同时在细胞重建过程中,这种薄膜材料可被基质金属蛋白酶和胰蛋白酶缓慢分解拍。

    自组装多肽具有细胞黏附特性和良好的生物相容性。Takeuchi等将自组装法制作的多肽纳米纤维水凝胶支架材料置于大鼠的三壁牙周缺损模型,2周后在缺损处产生了大量的纤维结缔样组织,4周后牙根表面形成了一薄层牙骨质,这种类牙周膜样的胶原纤维束斜行或垂直排列在牙根表面。

    1.2人工合成材料

    人工合成材料主要有聚乳酸(PLA)、羟基乙酸(PGA)以及聚乳酸一羟基乙酸共聚物(PLGA)等,这类线性脂肪类共聚物除了有良好的生物相容性外,还具有广泛的可降解性和加工灵活的特点。PLGA是由PLA和PGA聚合而成,在美国已通过食品药品管理局(FDA)认证。Shang等将大鼠PDLCs接种到纺丝均衡排列和无序排列的PLGA静电纺丝薄膜上,第3天发现PDLCs呈团块状迁移到薄膜的中心部位,并且均衡排列的纺丝薄膜上的细胞团块在第5天和第7天时已经融合,细胞的增殖能力更强。

    1.3复合支架材料

    由于单一的支架材料存在不同程度的缺陷,因此学者们开始将2种或2种以上的支架材料复合,以此充分利用两者的优势达到互补的效果。Zhong等在一项研究中比较了磷酸三钙/壳聚糖复合支架与纯壳聚糖支架的作用,结果显示:复合支架更能促进人PDLCs增殖,上调碱性磷酸酶(ALP)和I型胶原的表达;将其植入裸鼠皮下,4周后组织学染色显示支架材料孔隙中有新生的血管组织和牙骨质,并且植入区均没有炎症反应和感染现象。

    Jiang等成功利用静电纺丝法将聚合后的聚己内酯和聚乙二醇制作的薄膜与壳聚糖复合制成三维多相立体支架(聚乙二醇能提高聚己内酯的亲水性和降解速率,而壳聚糖则将多层薄膜联合),将该复合材料植人大鼠牙槽骨的骨开窗缺损模型后诱导骨膜蛋白的表达高于单独应用壳聚糖,I型胶原纤维与Ⅲ型胶原纤维比率明显上调,并且新生的牙周组织中纤维方向类似于天然的牙周组织。

    2生长因子

    生长因子是一种多肽类蛋白质,在组织修复过程中能促进细胞的增殖、趋化、新陈代谢等,对人体组织的修复和再生有着重要作用。血小板源生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGFs)、转化生长因子B(transforming growth factor,TGF-B)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等均可以促进牙周组织的再生。

    2.1 PDGF  研究发现,当PDGF-AB质量浓度为100 ng/mL,并且在培养48 h时,PDLCs的有丝分裂最旺盛,可以有效促进PDLCs的增殖,该因子对促进细胞的有丝分裂呈时间和剂量依赖性。Noda等将PDGF-BB应用于比格犬牙再植的研究,2周后发现牙周膜间隙中充满了由纺锤形细胞和毛细血管构成的新生结缔样组织,4周后在牙根表面有新生的牙骨质形成并且表面衬有成牙骨质样细胞,第8周时胶原纤维嵌人到新生的牙骨质和牙槽骨中,对照组则出现了不同程度的牙固连。

    2.2 IGFs   IGF-1能剂量依赖性地促进牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)的增殖,通过ERK和JNK MAPK通路促进其成骨分化,使ALP、RUNX2、OCN的表达上调,用质量浓度为100 ng/mL的IGF-1诱导PDLSCs 21 d后,茜素红染色显示矿化结节染色明显。

    有学者采用脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)成功在比格犬牙周缺损模型中诱导出了牙周组织的再生,酶联免疫法显示该细胞释放的众多生长因子中,IGF相关结合蛋白IGFBP-6表达最为显著;将IGFBP-6基因敲除后,ASCs的成骨分化能力明显降低。因此,IGFBP-6在ASCs促进牙周组织再生过程中扮演着重要的作用。

    2.3 TGF-β体外实验表明,TGF-β可以促进PDLCs分泌酸性蛋白和半胱氨酸,提高DNA和纤维蛋白的合成,并降低ALP活性。Rodrigues等发现,单独应用釉质基质衍生物EMD能显著促进PDLCs的增殖,而单独应用TGF-B1较EMD及二者的联合应用对PDLCs的黏附作用明显上调,镜下可见细胞呈树突状牢固附着于孔板底部,表明TGF-B 1和EMD对牙周组织再生有重要作用。

    2.4 bFGF  研究发现,bFGF能显著促进PDLCs的增殖,0.3%的bFGF能使牙槽骨高度增加明显。Nagayasu-Tanaka等利用人工构建的比格犬三壁牙周骨缺损模型,分别在骨缺损处和牙根表面进行组织病理学观察发现,牙周组织再生经历了3个阶段:肉芽组织阶段、纤维组织形成阶段和新骨形成阶段,bFGF组第7天时在肉芽组织的消失、牙根表面纤维组织的形成、新骨形成等方面均优于对照组。

    3种子细胞

    理想的种子细胞应具备以下特点:增殖分化能力强,植人机体后性能稳定,对受区环境适应能力强,取材容易对机体损伤小以及无免疫排斥反应等。

    3.1骨髓间充质干细胞(BMSCs)  Yu等怛刚用绿色免疫荧光蛋白将大鼠BMSCs标记后植入大鼠牙周缺损模型中,4周后观察到有大量的新骨和新生的牙骨质形成,功能性的牙周膜嵌入到新生的牙骨质中,在新生的牙骨质、牙周膜和新骨中均观察到大量免疫荧光标记后的BMSCs,表明BMSCs可以参与并调节牙周组织的再生。有学者将BMSCs接种在聚己内酯支架材料表面,经胰岛素-转铁蛋白-硒、TGF-B2、BMP-2、丙酮酸钠、地塞米松进行软骨分化诱导后植人大鼠三壁牙周缺损区,新骨的形成量明显增多,并可见平行排列的胶原纤维斜行嵌入新生的牙骨质和新骨中。

    3.2 PDLSCs  Mrozik等将体外培养纯化的羊PDLSCs与明胶海绵复合,植入第二前磨牙牙周缺损处,4N后组织学发现,新生的牙槽骨、牙骨质及沙比纤维明显多于未接种干细胞的对照组,且对照组结缔组织呈瘢痕样。有研究表明,PDLSCs促进牙周组织再生能力较其他来源的牙源性干细胞强。

    3.3 ASCs 脂肪组织具有数量丰富、容易获取、对机体损伤小等优点,在组织工程学中有着广泛的应用前景。Akita等将细胞膜红色荧光探针标记后的鼠ASCs接种到PLGA海绵支架后植入鼠的牙周缺损模型,5周后组织学染色发现在缺损处有大量密集排列的纤维结缔组织垂直附着在新生的牙骨质和新骨上;荧光显微镜下发现标记后的细胞大部分位于纤维结缔组织内,对牙周膜组织的再生促进明显。

    3.4 PDLCs  除上述干细胞之外,有学者发现单独应用PDLCs即可促进牙周膜的再生。Wang等心5j将狗PDLCs体外扩增后与藻酸盐凝胶复合,1个月后重新植入狗的自体牙槽窝中,2个月后形成了新生的牙骨质、牙周膜、牙槽骨样复杂牙周组织结构,而单独应用藻酸盐凝胶则出现牙固连。Iwata等利用维生素C诱导PDLCs产生细胞外基质制作细胞膜片,并且加入β-甘油磷酸钠和地塞米松诱导其成骨分化之后植入比格犬的三壁牙周缺损模型,6周后发现,在新生的牙骨质和新骨之间有新生的胶原纤维连接。

    3.5基因转染细胞  近年来有学者利用基因转染种子细胞,使其可自分泌某种特殊蛋白和因子来促进组织再生。Yang等在体外通过重组腺病毒载体将IGF-1、BMP-7基因转染人的PDLCs,基因转染后的PDLCs胶原和成骨分化能力明显增强。Zhang等以新型生物玻璃介孔材料作为载体携带腺病毒-PDGF-B、BMP-7植人比格犬的骨开裂牙周缺损模型,体内直接转染PDLCs,细胞转染后可分泌出PDGF-B和BMP-7,并且释放时间长达3周,牙周膜可恢复至原来高度的90%。

    综上所述,利用组织工程技术促进牙周膜再生有着巨大的潜能和应用前景,选择合适的支架材料和生长因子,寻求种子细胞的多种来源途径,多学科联合协作等是今后研究的重点。

编辑: 陆美凤

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