唾液蛋白质糖基化及其与全身和口腔疾病关系的研究进展

2018-11-9 11:11  来源:华西口腔医学杂志
作者:马瑞 彭显 徐屹 段丁瑜 阅读量:516

    唾液是一种由水、多种有机和无机物质组成的复杂生物体液。唾液中的绝大多数成分由唾液腺分泌,此外,一些分子可通过扩散(diffusion)、主动运输(active transport)及超滤作用(ultrafiltration)等生物过程从血液转运至唾液,同时它也包含来自龈沟液及口咽黏膜分泌物的成分等。与血清和其他体液类似,唾液中包含蛋白质、DNA、mRNA、microRNA等生物分子。

    唾液因其获取简单无创、不会引起患者的不适感等诸多优点,成为用于疾病生物标志物开发的理想体液。唾液中有超过2 000种蛋白质参与维持口腔内环境的稳态。蛋白质翻译后修饰(protein post-translational modification,PTM)使得细胞可对蛋白质活性进行调节,并在应对内外部环境变化时起关键作用。蛋白质糖基化是一种常见的PTM,超过50%的真核生物蛋白质被认为是经过糖基化修饰的。糖蛋白和糖基化在许多生物过程中发挥着重要作用,且具有重要的细胞功能,如增加蛋白质的稳定性、保护蛋白质免于降解、增加蛋白质溶解度以及调节蛋白质活性等。

    糖基化过程可由糖基转移酶的数量和定位以及可用底物量来调节,并且具有器官、组织和细胞类型特异性。然而这种平衡关系可因疾病被打破,当细胞从健康向疾病状态转变时,糖基化过程也会发生改变。目前临床应用的肿瘤筛查标志物中绝大部分是糖基化蛋白质,某些蛋白质糖基化的改变已应用于疾病的诊断、分期和预后评估,如应用于肝癌患者诊断和预后的核心岩藻糖基化(core-fucosylation)的甲胎蛋白(AFP-L3)。

    随着研究的展开,唾液中相关蛋白质的糖基化改变显示与多种全身系统疾病及口腔疾病相关,为疾病的诊治和预后提供潜在的分子标志物,有极大的开发潜力和应用前景。

    1. PTM

    处于未经修饰的折叠多肽形式时,绝大多数蛋白质是无法行使其分子功能的。在大多数情况下,为了行使功能,蛋白质需要获取永久性或暂时性的分子特征。PTM通常是通过特定氨基酸残基的剪切或共价结合完成的,前者不可逆,后者可逆。蛋白质合成后,多肽链在细胞的不同部位进行各种类型的翻译后修饰,如细胞核、细胞质、内质网和高尔基体等。蛋白质的修饰发生在多肽链折叠期间或之后,该过程涉及酶处理,包括从氨基末端去除一个或多个氨基酸,蛋白质水解剪切,以及在某些氨基酸残基上添加乙酰基(acetyl)、磷酰基(phosphoryl)、糖基(glycosyl)、甲基(methyl)或其他基团。这些修饰赋予蛋白质各种结构和功能特征。

    2. 蛋白质糖基化

    蛋白质糖基化是一种重要的PTM,真核细胞中的很多蛋白质都是糖蛋白,它们含有与特定氨基酸共价结合的寡糖链。除葡萄糖或果糖与赖氨酸残基结合等非酶促反应糖基化过程外,在生物系统中的糖基化通常是在酶促条件下进行。糖基化影响蛋白质折叠、定位与转运、溶解度、抗原性、生物活性、半衰期以及细胞间相互作用。根据氨基酸与糖连接方式,蛋白质糖基化有以下几种类型。

    2.1 N-糖基化

    N-糖基化修饰发生在天冬酰胺的残基上。发生N-糖基化的共同序列为天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸(Asn-X-Ser/Thr,其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)。少数情况下也发生在天冬酰胺-X-半胱氨酸(Asn-X-Cys)序列。在哺乳动物、植物、昆虫等生物体内,与天冬酰胺连接的糖几乎都是N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。经过一系列的糖基化修饰,最终在糖蛋白上形成5~15个糖的糖链结构,根据其末端精细结构的不同又可分为高甘露糖型、复合型和杂合型。许多细胞因子受体和转运蛋白经过N-糖基化修饰,如胰岛素受体等。

    2.2 O-糖基化

    O-糖基化多发生在邻近脯氨酸(Pro)的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)残基上。N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)在酶的催化下连接到蛋白质的Ser/Thr残基上,其他糖分子可进一步与半乳糖胺连接,使O-糖链得到延伸。通常O-糖基化比N-糖基化形成的糖链更短。黏蛋白中该类聚糖含量丰富,蛋白质的典型表现为脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸大量重复的结构域。

    2.3 其他类型

    C糖基化是指一分子α-吡喃甘露糖残基通过C-C键连接到色氨酸吲哚环上,且发生在基序W-X-X-W(有时也可为W-X-X-C或W-X-X-F)的第一个色氨酸上;糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosph ophatidylinositol,GPI)锚定连接是指通过糖磷脂酰肌醇基团结合蛋白质C末端从而使蛋白质与细胞膜连接,目前已有方法可预测这些结合位点。

    3. 唾液蛋白质糖基化与全身系统疾病

    唾液与血液或血浆中的蛋白质成分有20%~30%是重叠的,这表明唾液是有潜力作为系统疾病生物标志物的体液,它可能成为血液检测的替代性诊断手段。与血液、脑脊液、尿液相比,唾液的采集相对简单且无创。

    3.1 类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)

    RA是慢性自身免疫性疾病,可以引起免疫应答发生改变、滑膜内膜过度增生,从而导致患者关节疼痛和肿胀。在RA患者中,有研究发现硫酸化参与形成了滑膜液中主要的O-糖蛋白—润滑素,因此滑膜组织和滑膜液中O-聚糖的硫酸化被认为在RA的发病过程中起一定作用。Flowers等通过质谱检测选择反应监测扫描方式对RA患者唾液中黏蛋白MUC7的硫酸化或非硫酸化核心1-O-聚糖的异构体进行区分和相对定量,研究结果显示,与健康对照组相比,RA患者唾液中的黏蛋白MUC7核心1-O-聚糖硫酸化水平显著增高。

    3.2 胃癌

    许多证据表明,糖基化与肿瘤细胞的发生直接相关,如肝癌患者血清和组织蛋白可出现核心岩藻糖基化、外臂岩藻糖基化(outer-arm fucosylation)等糖基化改变,血清或细胞组织中的黏蛋白、表面受体、黏附蛋白等糖基化的异常改变可增加胰腺癌的侵袭性,但鲜少有学者报道唾液蛋白质糖基化与癌症的关系。Shu等使用凝集素芯片(lectin microarrays)比较健康志愿者、萎缩性胃炎患者、胃癌患者3组人群唾液中糖基结构的异同,结果发现3组之间有多达15种凝集素存在着显著差异。依据该15种凝集素建立胃癌和萎缩性胃炎的诊断模型,并获得较高的诊断效能。研究结果显示,与健康志愿者相比,唾液中由凝集素AAL和PSA识别的外臂岩藻糖基化及核心岩藻糖基化水平在胃癌患者中下调。对胃癌患者血清的研究也发现胃癌患者血清中核心岩藻糖基化水平较健康组显著降低。

    3.3 糖尿病

    在糖尿病前期和血糖控制不佳的2型糖尿病中升高的葡萄糖水平以2种方式影响着生物液体中的蛋白质生物标志物。第一种是直接的、非酶参与的蛋白质糖基化,葡萄糖分子的醛基和蛋白质赖氨酸残基中的氨基之间形成席夫碱(Schiff base)而与靶蛋白共价结合。另一种则是在细胞内进行糖基化修饰,当机体处于高血糖水平时,即可以通过己糖胺生物合成途径增加葡萄糖总量,由此提供UDP-GlcNAc和GalNAc前体与蛋白质结合。结合方式包括细胞内的O-糖基化及细胞表面和分泌蛋白的N-糖基化。

    Rao等将唾液蛋白质糖基化水平与临床常用血糖指标糖化血红蛋白(HbA1c)、果糖胺(fructosamine)、1,5-脱水葡萄糖醇和连续葡萄糖检测(continuous glucose monitoring,CGM)等进行相关性分析。研究发现,唾液蛋白质糖基化水平在基线测量时表现出与果糖胺(r=0.65)和1,5-脱水葡萄糖醇(r=-0.48)中等程度相关性,与HbA1c(r=0.3)相关性较弱。在检测第7、14、28天时,与果糖胺和1,5-脱水葡萄糖醇相比,唾液蛋白质糖基化水平与平均血糖浓度、最大血糖浓度以及血糖超过140 mg·dL-1的时间百分比等指标有更强的相关性。唾液蛋白质糖基化水平是否可用作短期监测血糖的非创伤性检测指标有待进一步研究。

    3.4 酒精依赖性

    Kratz等应用凝集素酶联免疫吸附测定法对酒精依赖性患者和健康人的唾液糖蛋白进行比较。研究结果表明,与健康对照组相比,酒精依赖性患者唾液中的核心岩藻糖基化、α2,3唾液酸化以及T抗原表达水平均显著下降。

    4. 唾液蛋白质糖基化和口腔疾病

    4.1 复发性阿弗他溃疡

    复发性阿弗他溃疡发病因素包括唾液组成成分、细菌、基因易感性等。黏蛋白作为唾液重要组成成分的糖蛋白,能润滑口腔黏膜以帮助咀嚼、说话和吞咽,介导口腔微生物的黏附等。黏蛋白及其O-糖基化影响到口腔健康的多个方面且在应对感染和炎症时会发生改变。Zad等使用液相色谱-串联质谱法研究复发性阿弗他溃疡患者和其健康同胞黏蛋白MUC7的O位连接寡糖的异同。

    研究发现,两组人群黏蛋白MUC7的糖基化类型无明显差异,然而进一步半定量分析表明尽管两组人群的寡糖骨架是相同的,但是岩藻糖、唾液酸(sialic acid)、硫酸化对该寡糖骨架的修饰在两组之间具有显著差异。这些单糖在溃疡组明显减少,尤其观察到唾液酸的大量减少。Zhang等分别在8位绝经期口腔溃疡女性患者的患病期和治愈后期采集唾液,联合应用稳定同位素二甲基标记(stable isotope dimethyl labeling),亲水相互作用色谱富集(HILIC enrichment)以及高分辨质谱(high resolution mass spectrum)等方法,定量分析口腔溃疡患者唾液中的全部蛋白质及N-糖基化蛋白质组。105个糖蛋白中162个N-糖基化位点被发现,其中前后差异达到1.5倍的蛋白质中11种糖蛋白被上调,30种糖蛋白被下调。同时,几种经糖基化修饰的酶的水平也降低,包括基质金属蛋白酶-9、α-淀粉酶1、麦芽糖苷酶(maltase-glucoamylase)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase)、二肽基肽酶1(dipeptidyl peptidase 1)和三肽基肽酶1(tripeptidylpeptidase1)。已有文献报道N-糖基化在酶活性和分泌中起重要作用,因此糖基化水平的降低会损害这些酶的活性。

    4.2 龋病

    龋病在人群中的分布不均匀,鉴别龋病易感风险高的人群对于及时防治以及避免过度治疗均有极大益处。黏蛋白MUC7具有各种抗微生物活性,有文献报道,老年受试者唾液中黏蛋白MUC7的浓度与变异链球菌呈显著负相关。唾液糖蛋白包含有大量特异性的寡糖基序(oligosaccharide motifs),牙齿表面获得性膜中的糖蛋白可以提供细菌特异性的结合位点以促进细菌的黏附和定植。另一方面,未参与获得性膜组成的糖蛋白中某些寡糖可以与浮游菌相互作用并降低其在牙齿表面的黏附能力,因而糖蛋白在口腔微生物的定植过程中可能扮演着重要角色。Denny等发现年轻人唾液中MUC7的2种寡糖的比例与龋病(龋坏及因龋充填史)有很强的相关性。然而,Zehetbauer等对低龄儿童龋病因的研究却显示低龄儿童龋组与无龋对照组间唾液蛋白质糖基化水平高度相似。

    4.3 口腔异味

    90%口腔异味患者病因来源于口腔。作为口腔异味主要来源的挥发性硫化物是由厌氧细菌代谢产生的,唾液为之提供了易于降解的蛋白质底物,而蛋白质中碳水化合物组分通常会干扰蛋白质的水解。Takehara等分别采集了67名口腔异味患者和21名健康人的唾液,并对唾液中的蛋白质和糖蛋白进行分析,发现两组之间主要蛋白质和糖蛋白分布无统计学差异,但在口腔异味患者组发现,唾液蛋白质浓度与甲硫醇(CH3SH)水平呈正相关,唾液蛋白质中碳水化合物含量与H2S水平呈负相关。这些结果提示唾液中的蛋白质浓度和糖蛋白组分可能与口腔异味的产生有关。

    4.4 口腔干燥症

    口腔干燥症是一种由多因素导致的口腔症状而不是独立疾病,常表现为唾液黏稠、口唇干裂、黏膜烧灼感并影响患者吞咽、咀嚼、语言等口腔功能。除了静息唾液(unstimulated whole mouth saliva,UWMS)的量与口腔干燥联系紧密外,口腔黏膜表面的残留唾液(residual mucosal saliva,RMS)不足也会导致口干感觉。因此,对唾液进行定性分析很有必要。黏蛋白及其O-糖基化除了能够阻止病原菌到达和附着在黏膜表面外,黏蛋白中的聚糖成分对于维持唾液的黏弹性很重要,有文献报道当黏蛋白中聚糖成分降解时唾液的黏弹性下降。

    Chaudhury等对有口干感觉的患者UWMS和RMS进行定性分析,发现口干患者与健康对照组相比黏蛋白的糖基化水平降低。Chaudhury等在另外一篇文献报道中对比舍格伦综合征有口干症状的患者以及健康人唾液成分后表明,尽管黏蛋白MUC5B和MUC7在两组中的浓度相似,但是免疫印迹实验结果发现舍格伦综合征组黏蛋白的糖基化水平与对照组相比有降低。

    4.5 牙周炎及牙周再生

    牙周炎是由牙周局部菌斑生物膜作为始动因素,以牙周组织破坏、牙槽骨吸收和病理性深牙周袋作为主要特征的慢性感染性疾病。研究发现IgG的糖基化改变会影响IgG的免疫活动,并在多种疾病状态中表现出与炎症相关。Stefanović等探究了轻重度牙周炎和健康人群唾液中IgG各亚类的成分和半乳糖基化情况。结果发现,尽管无论牙周处于何种状态,IgG2该亚类都在数目上占绝对优势,然而在健康者及轻度牙周炎患者,在IgG重链中检测到半乳糖表达,但是重度牙周炎患者中半乳糖含量处于几乎不能被检测水平。该结果提示,在牙周炎症进展的过程中,唾液中IgG的半乳糖基化发生改变。

    此外,在牙周组织愈合与再生方面,Gabriel等通过体外实验表明,唾液中黏蛋白糖基化可与抑制细胞黏附相关。继而提示,在牙周伤口愈合早期,根面和种植体表面在唾液中的暴露会通过抑制口腔角质细胞和成纤维细胞在其表面的定植而影响伤口愈合,从而加强了上皮结合而非组织再生的愈合方式。

    4.6 口腔癌

    口腔癌在年轻人群中的发病率持续攀升,其5年致死率几乎达到50%。异常糖基化改变是癌症的普遍表现,多种糖复合物的组成成分如唾液酸在各类恶性肿瘤中都有增加。在对唾液的研究中,Dadhich等分别采集健康人、口腔潜在恶性疾病(oralpotentially malignant disorders,OPMD)患者以及口腔癌患者的UWMS以检测唾液酸水平。研究表明从健康组、OPMD到口腔癌组,唾液中唾液酸的水平依次递增并具有统计学差异。Sanjay等对口腔癌和健康人唾液中唾液酸水平也进行了对比,并得出相似的结论。

    5. 展望

    蛋白质糖基化是一种重要的PTM,是真核生物蛋白质功能调节的基本环节,异常糖基化往往伴随着异常的生理或病理过程。疾病的准确诊断对于实施有效的治疗措施至关重要。目前,疾病诊断方式的发展主要受到3个方面的限制:较难寻找与疾病相关的特定生物标志物、微创简单且经济的方法以及便捷易用的诊断平台。因此,唾液采集简单、经济、无创等诸多优势使得唾液在疾病诊断中的作用引起研究者的广泛兴趣。目前的研究显示唾液中蛋白质糖基化与多种疾病相关,未来还需更多的基础及临床研究进一步揭示唾液蛋白质糖基化与各种全身系统疾病和口腔疾病的关系,为相关疾病提供新的诊断和治疗思路。

编辑: 陆美凤

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