年轻恒牙是指未完全发育成熟、根尖孔未完全闭合的恒牙。其常因外伤、发育异常等原因导致牙髓坏死而致根尖停止发育。虽然根尖诱导成形术已取得了一定的临床效果，但因其不能使患牙牙根继续发育，所以术后仍存在根折的风险。近年来，随着分子生物学、再生医学等相关学科的迅猛发展，牙髓再生引起学者们的高度关注。研究表明，牙髓干细胞及其相应的支架与生长因子的协同作用是临床牙髓再生成功的关键。
目前，临床常用的方法为刺激根尖区出血，使根管内形成支架样结构的血凝块后引导牙髓再生，但实际应用中常出现刺激根尖出血时未形成血凝块或血凝块形成质量不佳的情况。因此，如何获得牙髓再生的良好支架基质成为研究热点。富血小板纤维蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）作为良好的支架基质在牙髓再生治疗中已得到较好的疗效评价，但缺乏长期的临床随访观察及预后评估资料，从而严重制约了该技术在临床上的推广。同时，PRF用于牙髓组织再生的组织学机制尚无定论，其作为牙髓再生的理论基础与临床应用也仍需进一步研究。现就PRF应用于牙髓再生的研究进展予以综述。
1.PRF的制备
由Dohan等提出的PRF的制备方法如下：用真空采血管（不含任何抗凝剂）抽取10mL静脉血，即刻在400×g（3000r/min）离心力下离心10min，静置5min；离心后血液分为3层：上层为无细胞血浆，中间层为PRF，下层为红细胞；然后用两块无菌纱布在一干净的金属平底器械皿上轻柔挤压便可得到PRF蛋白膜。这一制备方法简单快捷，因而被绝大多数临床医师采用。但在不同的离心材质和离心速度下，PRF释放生长因子的量不同。
程亚楠等分别采用3种离心速度（2500r/min、3000r/min、4000r/min）制备PRF，结果发现2500r/min、3000r/min离心速度下制备的PRF，血小板与白细胞的回收率及转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β1、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）AB的释放量均高于离心速度为4000r/min。他们认为，这可能因为在低转速状态下，比重小的血小板和白细胞多游离在离心管的上方，而未添加抗凝剂的血液接触血管壁后立刻启动内源性凝血系统，将白细胞和血小板网络在PRF凝胶中；而采用4000r/min离心速度时，由于离心率增大，白细胞和血小板在纤维蛋白原变成纤维蛋白单体形成网状结构之前就已经沉降至离心管底部。
李艳秋等分别采用玻璃材质和塑料材质的离心管制备PRF，结果发现玻璃材质组PRF释放的PDGF-AB、TGF-β多于塑料材质组，这与李龙等的研究结果一致。因此，为了能使PRF更好地释放生长因子，临床上制备PRF时建议在2500r/min或3000r/min转速下使用玻璃离心管进行离心。
2.PRF的结构和成分
PRF凝胶用肉眼观察可以分为3个部分：上端为黄色的纤维蛋白基质，下端为少许红细胞，位于两者之间的白色区域为白膜层，具有一定的弹性和韧性。何璇通过组织学方法观察PRF的结构发现，PRF的主要结构是由纤维蛋白条索聚集形成的三维立体网状结构，且不同区域纤维蛋白网的致密程度不同；扫描电子显微镜显示，PRF的红细胞层纤维蛋白网排列稀疏而纤细，白膜层的纤维蛋白网则粗大而致密，且血小板和白细胞主要分布于白膜层。此外，为了证实PRF凝胶中的生长因子主要聚集于白膜层，何璇将收集得来的PRF凝胶析出液分为3组（完整PRF凝胶组、含白膜层的PRF凝胶下段组及不含白膜层的PRF凝胶上段组）分析其生长因子的释放情况。结果发现，含白膜层的PRF凝胶下段组在24h、72h、120h释放的PDGF-BB、TGF-β1、胰岛素样生长因子1水平均高于完整PRF凝胶组，而不含白膜层的PRF凝胶上段组仅在24h检测到少量PDGF-BB，其余时间点均未检测到以上因子的释放，故证实白膜层为PRF凝胶释放生长因子的主要部位。
孙洁等用同样的方法观察PRF与富血小板血浆的超微结构发现，PRF的主要结构是由纤维蛋白形成的疏松多孔的网络结构，大量的白细胞及血小板存在于蛋白网中，而纤维蛋白的形成首先是由多个管状亚结构组成，然后亚结构才慢慢组合成疏松的网络结构，这提示纤维蛋白原是在离心力的作用下缓慢凝集而成，也正由于其凝聚缓慢，才能形成疏松且多孔的网络结构，有利于细胞的定植和细胞因子的捕获。而富血小板血浆是通过添加凝血酶和氯化钙处理后获得，由于其形成速度快，形成的网格结构坚固，不利于细胞的定植和细胞因子的捕获。PRF内的血小板和白细胞被活化后能够释放大量的生长因子，除TGF-β1、PDGF-AB、胰岛素样生长因子1外，还能释放白细胞介素（interleukin，IL）1β、IL-6等促炎因子、抗炎因子（IL-4）及血管内皮细胞生长因子等。Dohan Ehrenfest等测得，血液中接近97%的血小板和＞50%的白细胞存在于PRF凝胶中并呈现特定的三维分布，且其特定的三维结构不受不同的测试集合管和浓缩技术的影响，这两者仅影响其生长因子的数量和生物矩阵的特性。
这与丁俐丹等采取比格犬前肢静脉血5mL制备PRF凝胶，通过血细胞分析仪检测得出PRF中血小板和白细胞的回收率分别为95.01%和86.61%的实验结果基本一致。基于PRF的这些特殊结构及被活化后可以释放大量的生长因子，其被广泛用于口腔组织再生中，如牙周手术、植骨、种植术及口腔颌面外科重建术等。
3.PRF用于牙髓再生的相关研究
3.1牙髓再生的发展历程
Iwaya等提出，年轻恒牙发生牙髓坏死后，在根管相对无菌状态下，牙根有继续生长发育的可能。Banchs和Trope证实了Iwaya等的观点，并由此正式提出了牙髓血运重建术的概念。现大多数学者称其为牙髓再生治疗，即不通过机械预备根管，而是通过严格的药物消毒，使根管内发生坏死的牙髓组织变成无菌基质，然后刺激根尖出血，待血液进入根管并形成血凝块后再进行严密的冠部封闭，以促进根管内新的类牙髓样组织形成，进而促使牙根继续发育。越来越多的学者在临床上运用牙髓血运重建术治疗年轻恒牙根尖周病变，通过影像学表现均能看到根尖孔闭合，部分病例还可看到根管长度和厚度有明显的变化。
在牙髓再生中起关键作用的因素主要有3个，分别为牙源性干细胞、生物支架及生长因子。由于PRF特殊的三维结构可以充当支架，且可以释放大量的生长因子，所以学者们逐渐开始研究其在牙髓再生中的应用。
3.2PRF用于牙髓再生的相关实验研究
何璇从需要拔除的牙体完整无龋的前磨牙和第三磨牙中分离培养人牙髓细胞（huaman dental pulp cells，hDPCs），分别接种在PRF析出液水平（体积分数）为25%和75%的培养基及常规培养基上进行培养，结果发现随着时间的推移，尤其是培养120h、144h、168h后，两种PRF凝胶析出液均可促进hDPCs的体外增殖，但其促进作用无水平依赖性，推测可能25%的PRF凝胶析出液水平足以使hDPCs的增殖达到平台期。同时，有学者用同样的方法获取犬牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs），经流式细胞术和多向分化鉴定后分别放在3种水平（含自体PRF体积比分别为1/8、2/8、3/8）的PRF培养基中进行培养，采用MTT法检测不同时间点细胞的增殖活性，聚合酶链反应技术检测碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白1（dentin matrix acidic phosphoprotein1，DMP1）信使RNA的表达水平，结果发现不同水平的PRF均能促进DPSCs的增殖，且不同水平的PRF均可通过上调成牙本质/成骨早期标志基因（碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白）信使RNA及晚期标志基因（DMP1）信使RNA的表达来促进犬DPSCs向成牙本质或成骨分化。此外，他们通过制作DPSCs/PRF双膜复合物放入人牙根片后移植至裸鼠皮下进行体内实验培养，经过8周的裸鼠体内移植后通过苏木精-伊红染色发现人牙根片段髓腔内有新生组织充填，有类牙髓牙本质样结构形成。
另有学者通过建立犬年轻恒牙根尖炎模型并分为空根管组和PRF凝胶组进行疗效比较，上方均置入三氧化矿物凝聚体（mineraltrioxide aggregate，MTA），冠方封闭12周后分别通过X线射影和组织学分析其根管变化情况，结果发现PRF凝胶组根管壁明显增厚，且根管内有骨样矿化物、结缔组织等形成。可见，PRF的参与可以促进牙髓再生。
3.3PRF用于牙髓再生的相关临床病例报道
由于相关实验研究的成功，许多科研工作者将PRF应用于临床牙髓再生的治疗，并取得了较好的临床疗效。Nagaveni等对1例因外伤致其左上中切牙出现牙髓坏死的10岁男孩进行治疗，通过使用三联抗生素（甲硝唑、米诺环素、环丙沙星）消毒根管后将PRF膜导入根管，并在上方放置MTA，冠方用玻璃离子充填。3个月后，X线显示牙根出现继续发育，根尖孔也开始关闭；6个月后，X线显示根管壁增厚、根尖孔也较前缩小；9、12个月后，X线显示根尖孔完全闭合，根管壁显著增厚，因而粗大的根管腔明显变窄，且对冷水测试和电活力测试也有反应。
另有学者对1例因龋病导致其左下第2年轻恒磨牙出现根尖周炎的13岁男孩进行治疗，初诊时患牙有明显的叩痛且X线显示其根尖大面积低密度影像，通过去净龋坏组织后使用三联抗生素消毒根管，冠部暂封，3周后复诊，冲洗干燥后髓腔内置入PRF膜，并在其上方放置biodentine牙本质修补材料，复合树脂封闭冠方。3个月后，患牙无自觉症状；6个月后，X线显示根尖阴影面积较前缩小，牙根延长；12个月后，根尖阴影完全消失，根管壁增厚，根尖孔基本闭合，硬骨板出现，冷水测试和电活力测试同对照牙。
有文献报道，印度学者用同样的方法治疗1例右上中切牙年轻恒牙伴慢性根尖炎的7岁男孩，治疗后7个月触诊和叩诊均为阴性，X线示根管壁增厚，牙根也继续延长；12、15个月后根尖孔闭合，且冷水测试和电活力测试同邻牙。此外还有临床研究表明，PRF的参与确实可以促进年轻恒牙感染根管牙根的继续发育和根管壁的增厚。
3.4PRF用于牙髓再生的机制分析
在任何组织再生过程中，细胞的增殖和分化均离不开良好的支架，且干细胞的分化与细胞外基质和粘连分子密切相关。有研究发现，PRF作为生物活性支架可以通过促进细胞的增殖、迁移和细胞外基质的合成来促进兔半月板的修复。Yang等将牙囊细胞接种到纤维凝胶与PRF混合的支架上，移植到原来的牙槽窝内，36周后发现再生的牙齿结构包括牙冠、牙根、牙髓、牙骨质、牙周膜等；且免疫组织化学还可以观察到牙本质高度表达DMP1，这证明PRF作为支架可以促进牙齿主要成分的再生。
恒牙根尖部未发育完成的软组织为根尖牙乳头，其与根部牙髓组织之间的根尖为根尖部细胞富聚集区，富含大量具有成体干细胞特征的牙乳头干细胞、DPSCs等。Chrepa等研究发现，虽然年轻恒牙出现了根尖炎症，但在根尖部仍可检测到部分存活的牙乳头干细胞，这些牙源性干细胞在牙髓再生中起重要作用。
在牙髓再生中，可以通过以下3种方法获取干细胞：
①干细胞移植。干细胞移植可以控制细胞的数量并选择对牙髓再生最佳的细胞亚种，但目前通过干细胞移植实现牙髓再生的研究成果只是局限于动物实验，进入临床试验的比较罕见。
②细胞归巢。细胞归巢是指宿主内源性干细胞在多种因素的作用下，定向趋向性迁移至靶向组织并进行增殖和分化。张立霞通过小鼠尾静脉移植的绿色荧光蛋白标记技术标记的骨髓基质干细胞可以归巢至牙齿根管内实现类牙髓样组织的再生，这表明系统性来源的骨髓基质干细胞可以在牙髓再生中发挥一定的作用，但这一实验结果尚未得到大量的临床资料验证。
③诱导根尖出血。诱导根尖出血使根尖区的干细胞涌入根管系统内是目前中国行牙髓再生术时的主流，但有时刺破根尖后出血量少甚至不出血，且将MTA放置到血凝块上的操作难度大，会影响干细胞的数量及生物支架的形成，而PRF由于有特殊的三维结构，故可以充当良好的支架。虽然目前参与牙髓再生的相关干细胞来源尚未十分明确，但临床上结合自体PRF进行牙髓再生术得到了良好的效果，推测可能是年轻恒牙根管系统内或根尖部的牙源干细胞参与。PRF既可以充当良好的支架，又可以释放大量的生长因子，对牙源性干细胞的聚集、迁移和增殖等起到至关重要的作用，从而促进牙髓的再生。
4.小结
牙髓再生的出现为临床治疗年轻恒牙牙髓坏死提供了新的选择，它较传统根尖诱导成形术有以下优势：①牙根的继续发育增加了冠根比例，牙齿更加稳固；②根管壁的增厚增加了牙周膜面积，使牙齿能更好地发挥其作用；③减少患牙今后因其他原因需要行根管治疗而致侧方加压时发生根折的风险，且容易获得良好的根尖封闭。PRF制备方法简单，可操作性强，同时具备三维立体网状纤维蛋白支架结构及富含大量生长因子的生物学特性。虽然其在年轻恒牙牙髓再生的临床治疗中已取得较好的疗效，但PRF运用于牙髓组织再生的组织学机制及临床应用机制尚需要深入研究，以为其推广应用奠定基础。
