牙周炎是累及牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）的慢性感染性疾病，是口腔中的常见疾病，也是成人失牙的首要原因，严重影响口腔乃至全身健康。其始动因子为牙菌斑生物膜，细菌通过激活宿主的一系列免疫炎症反应，最终形成牙周病变。
临床主要表现为牙龈炎症出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收、牙松动移位等，最终可导致牙齿缺失。虽然细菌是牙周炎的始动因子，但疾病随后的进展和严重程度被认为是由宿主对局部抗原所产生的免疫应答所决定的。研究表明，牙周组织损伤常与机体免疫应答所引发的炎症相关，当病原菌入侵牙周组织时，机体可通过局部或全身等各种免疫途径影响牙周炎的发生、发展，且免疫在牙周炎病变的发生发展中常表现为“双刃剑”的作用。其中许多细胞类型，特别是多形核白细胞，巨噬细胞，淋巴细胞和成纤维细胞均参与其中。
近年来研究显示，T细胞浸润是牙周炎病损的重要病理特征，提示T细胞介导的免疫紊乱在疾病的发生发展中发挥重要作用。测定T细胞中T细胞受体（T cell receptor，TCR）互补决定区3（complementarity-determining region3，CDR3）谱系分布特征能够反映牙周炎疾病进展中特异性T细胞克隆的扩增情况，对T细胞TCR CDR3谱系特点的进一步研究将有助于阐明牙周炎的免疫发病机制。
1.T细胞免疫应答与牙周炎
当牙周组织遭受病原体的入侵后，首先触发人体防卫功能的第一道防线，即非特异性免疫反应，识别并引发免疫反应以消除非自体微生物。除了非特异性免疫反应，特异性免疫细胞和相关特征性细胞因子已被描述为牙周炎发病机制中的重要参与者，特别是CD4阳性T淋巴细胞。
目前，大量研究认为牙周炎局部免疫反应的平衡破坏与T细胞亚群中辅助性T细胞（T helper cell，Th）1、Th2、Th17以及调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）在牙周局部形成复杂的细胞因子网络密切相关。其免疫反应的不同模式可增强炎症反应，介导破骨细胞生成，从而导致牙周组织的破坏，并最终导致牙齿脱落。未致敏的CD4+T细胞受到抗原刺激后，可分化为Th0细胞，Th0细胞经T细胞受体活化后在不同的细胞因子作用下分化为Th1、Th2、Th17、Treg细胞。其中Treg细胞包括自然发生的Treg细胞（natural regulatory T cell，nTreg）和诱导性的Treg细胞（induced regulatory T cell，iTreg），而nTreg是在胸腺细胞成熟的过程中自然分化所形成的。
研究显示，慢性牙周炎患者牙龈组织中白细胞介素（interleukin，IL）-17和干扰素（interferon，IFN）-γ蛋白水平及T盒转录因子（T-box expressed in T cells，T-bet）mRNA水平显著升高，提示局部Th17和Th1细胞升高可能参与了慢性牙周炎的发病机制。由Treg细胞产生的IL-35可下调Th17细胞的发育并抑制自身免疫性炎症反应，从而抑制牙周炎等炎症条件下的过度免疫反应，且在重度牙周炎患者牙龈组织中转录因子GATA-3的水平较牙周健康患者显著降低。
以上研究提示，Th1、Th17在牙周炎的发生发展中可能具有促进作用，而Th2、Treg可能抑制牙周炎的进展。近年来最新发现的CD4+T细胞亚群Th9、Th22通过分泌IL-9、IL-22等细胞因子介导细胞免疫应答。相关研究发现，牙周炎患者龈沟液中IL-22水平明显升高，且与临床附着丧失呈正相关；而在牙龈炎患者中检测到的IL-9和转录因子Spi-B水平高于牙周炎患者和健康人群。
Tfh细胞能高表达趋化因子受体CXCR5（CXC-chemokine receptor 5）和转录调控因子Bcl-6（B cell lymphoma 6），分泌特征性细胞因子IL-21，辅助Ｂ细胞产生保护性抗体参与持久性体液免疫应答。
2.TCR CDR3
2.1TCR CDR3的结构特征
尽管T细胞在牙周炎的发病机制中起着重要作用，但T细胞在机体内发挥免疫调节作用的具体机制尚未完全阐明。T细胞通过TCR识别抗原，TCR属于免疫球蛋白超家族，是T细胞表面关键的受体分子及与抗原结合的关键部位，由α、β链或γ、δ链构成，现已知约95%的TCR由α、β链组成，且大部分TCR序列都集中在β链。结构上TCR由可变区（variable region，V区）和恒定区（constant region，C区）构成。其中，编码V区的基因包括V（variable）基因片段、D（diversity）基因片段、J（joining）基因片段，编码C区基因为C基因片段。V、D、J基因片断经过重排或连接时插入、剪切一定数量的核苷酸等机制而形成多样性的抗原互补决定区（CDR1、CDR2、CDR3），其中“CDR3区”（又称超变区）组成最具多样性的CDR3受体库。
在TCR抗原识别结构中，CDR3区决定了TCR的特异性，进而产生不同的T细胞克隆，而不同克隆的T细胞与抗原识别及免疫应答密切相关。研究显示，健康个体TCR CDR3谱系呈对称型、钟型分布，而在疾病状态下T细胞出现寡克隆增生现象，TCR CDR3呈偏态分布。因此，对TCR CDR3受体库的检测不仅有利于研究特定免疫状态下的T细胞应答情况，且对疾病发生机制的研究及诊断、治疗策略的开发均具有积极意义。
2.2TCR CDR3谱系的检测方法
Southern印迹杂交法：通过TCR CDR3聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）产物杂交后在电泳带上的集中或分散来判断各V基因家族产物的分布，以分析T细胞的克隆性。FQ-PCR溶解曲线法：采用荧光定量PCR技术扩增样本的TCR CDR3区，用DNA熔解曲线法分析TCR CDR3的单、寡、多克隆性及TRBV基因家族的表达情况。
PCR-变性聚丙烯酰胺凝胶银染法：PCR产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶分离后经特殊银染，从而显示出TCR CDR3基因表达的谱型图。其他检测方法还有：PCR-单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）分析；流式细胞TCRβ链抗体检测法；毛细管电泳技术及免疫扫描谱型分析技术等。
近年来，高通量测序技术通过多重PCR或5’RACE（5’rapid amplification of cDNA ends）扩增的方法结合高通量测序，可获得上百万条序列，其高效、灵敏的特点，为疾病的分子发病机制研究提供了良好的技术手段，是目前被高度认可的最为优化的测序方法。随着测序平台的不断升级，该技术已广泛应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病等TCR CDR3的谱系研究中。
2.3TCR CDR3谱系与牙周炎
Zadeh等使用超抗原证实高达50%的T细胞表达一种或几种TCRVβ基因家族，表明超抗原可能构成T细胞激活的主要途径，从而加重牙周病变。超抗原以高亲和力直接与主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）-Ⅱ类分子的抗原结合沟槽外侧结合形成配体，该配体与T细胞受体的Vβ区结合，从而高频率地激活T细胞，并引起T细胞受体可变区基因家族的大量活化。此外，该研究小组用单克隆抗体及流式细胞仪检测牙周炎患者牙龈组织中T细胞TCRVβ基因家族，显示部分牙周炎患者牙龈组织中Vβ5a、Vβ5b、Vβ6、Vβ12高表达；而在所有牙周炎患者中，Vβ8+T细胞都有一定程度的升高。提示T细胞受体Vβ家族在牙周炎患者中存在偏移表达，其偏向取用的基因可能和疾病的发生及进展有关。
Yamazaki等用PCR研究牙周炎牙龈组织及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中TCRVβ基因的表达，结果显示在牙龈组织中Vβ6、Vβ16过表达，表明携带这个基因家族的T细胞在牙周炎病变中具有重要意义；随后，研究者对牙周炎T细胞Vβ16基因通过SSCP技术和CDR3区的DNA测序发现，所有牙周炎患者牙龈组织T细胞均表现出明显的寡克隆性，且在CDR3区发现了保守的氨基酸基序，即G-X-G。提示可能存在针对牙周炎特异性抗原产生应答的T细胞。
为了进一步探究Vβ6TCR CDR3谱型特点，Ohsawa等利用RT-PCR-SSCP对10名中重度牙周炎患者牙龈组织及PBMC的T细胞受体Vβ6CDR3区域的核苷酸序列及氨基酸取用进行分析，发现部分牙周炎患者牙龈组织中存在重复的核苷酸序列；同样揭示了Vβ6T细胞在牙周炎患者的CDR3区域中具有共同的氨基酸基序的积累，即：L-S-S-G，L-A-S-G，L-X-G，L-X-X-G，提示其可能为特异性抗原的识别位点。
通过对氨基酸取用分析显示，牙周炎患者高频取用第4位的亮氨酸与第8位的甘氨酸，并发现Jβ2.1、2.2、2.3、2.7基因在牙周炎患者牙龈组织及PBMC中均高表达，提示牙周炎患者取用了特定的Jβ基因片段，为进一步研究牙周炎个性化治疗提供了一定的基础。然而，Berglundh等发现牙周炎病变中Vβ17是最常见的TCR标记基因，其次是Vβ5，Vβ8和Vβ13基因家族，这与之前的研究报道稍有差异，推测这可能与超抗原的刺激或个体异质性有关。
随后的研究发现，牙周炎PBMCTCRVα、β基因的表达与健康对照组相似；且在牙周非手术治疗后牙龈组织中TCR表达谱显著下降，而PBMCTCR基因分布没有明显的变化。在青春前期牙周炎牙龈组织中以表达Vβ17为主，而成人牙周炎中主要表达Vβ2基因。
以上研究提示，牙周炎病变部位可能存在特异性的T细胞克隆，且与牙周局部环境的改变密切相关。Yamazaki等使用抗人类白细胞抗原（human leucocyte antigen，HLA）的II型分子HLA-DP、HLA-DQ、HLA-DR单克隆抗体研究MHC对人热休克蛋白60（heat shock protein 60，HSP60）增殖反应的限制，发现HSP60反应性T细胞克隆受HLA-DR的限制。
HSP60刺激后TCRβ链CDR3区核苷酸序列结果显示，在牙龈组织中观察到比PBMC更为明显的T细胞克隆积累；并揭示了牙周炎免疫过程中存在氨基酸序列的保守性。而非氨基酸保守位点的频率增加可提高CDR3区的多样性，与更多的抗原结合发生免疫应答。大量研究表明，αβTCR CDR3谱系与牙周炎的发生发展密切相关。但利用高通量测序技术对牙周炎免疫机制的研究鲜见报道，相关研究大多集中在微生物群落构成与分布等方面。
最近，Kim等则运用高通量测序技术在牙周炎患者中发现集落刺激因子3（colony-stimulating factor 3，CSF3），补体受体2（complement receptor 2，CR2），脂多糖结合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP），基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase3，MMP3）和血清淀粉样蛋白A1（serum amyloid A1 protein，SAA1）等400个与细胞因子和免疫应答相关的上调基因，揭示了牙周炎牙龈组织中基因选择性剪接的广泛信息。
3.展望
综上所述，T细胞在牙周炎免疫发病机制中发挥着重要作用，而TCR决定了T细胞的特异性免疫应答，提示TCR CDR3谱系的构成与牙周炎的发生和发展密切相关。早期，Yamazaki等发现RT-PCR-SSCP是分析牙周炎T细胞免疫应答、研究疾病发病机制的有力工具，但其仍具有一定的限制性，对牙周炎TCR CDR3谱系的研究较为局限，其详细特征有待进一步阐明。
对T细胞不同亚群的TCR CDR3谱系的进一步深入研究，探讨TCR偏向取用情况，尤其是应用高通量测序技术寻找牙周炎特定T细胞亚群相关CDR3序列、独特的基因取用及氨基酸分布等特征，将为牙周炎的发病机制研究和个性化治疗提供新的方法与手段。
