摘　要：目的：观察维甲酸（RA）对小鼠磨牙牙胚BSP mRNA 表达的影响，探讨RA在牙胚早期发育中的作用。 方法：将16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚置于含外源性RA（5×10-8mol/L）的 RPMI 1640半固态培养基表面，分别培养4、5、6d。培养结束后提取总 RNA，经 RT-PCR 扩增30循环后，采用 Southern 印迹法检测BSP mRNA 在牙胚组织中的表达。结果：体外培养4d后，实验组（含外源性RA ）和对照组（不含外源性RA）的牙胚组织中BSP mRNA 的表达均为阴性。培养5d后，实验组的牙胚开始表达BSP mRNA，对照组的牙胚仍为阴性。培养6d后，实验组牙胚BSP mRNA 的表达明显增强, 对照组的牙胚也开始表达BSP mRNA，但表达强度明显低于实验组的牙胚。结论：RA具有诱导牙胚组织细胞分化的功能。
关键词：维甲酸； 骨涎蛋白； 牙胚； RT-PCR； Southern印迹杂交

　　牙齿发育异常是临床上常见的牙体非龋性疾病，与遗传、营养以及某些药物的作用有关。维甲酸（retinoic acid, RA）为一种类固醇激素，是维生素A在体内代谢后的主要活性产物，具有多方面的生物学功能，是维持胚胎正常发育所必需的成分之一。以往研究表明，缺乏RA可妨碍鼠磨牙牙胚冠部形态的发生［1，2］。骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)为一种矿化组织特异性非胶原糖蛋白，与硬组织矿化有密切关系［3］。在牙胚发育过程中，BSP mRNA在牙胚组织的成牙本质细胞和成釉细胞中呈特异性表达［4］。本研究旨在通过观察RA对钟状期早期的鼠磨牙牙胚BSP mRNA表达的诱导，探讨RA在牙胚组织细胞分化中的作用。

1　材料和方法

　　昆明小鼠(第四军医大学动物实验中心提供)。小鼠胎龄以交配后次日见到阴道栓的时间为0d。将胎龄为16d的昆明小鼠断颈处死，浸入750ml/L乙醇中消毒15s。取胎鼠下颌骨，体式显微镜下于Hanks液(含青霉素1×105U/L, 链霉素0.1g/L)中分离下颌第一磨牙牙胚。牙胚在预冷至4℃的Hanks液中充分洗涤后, 置于含外源性RA(5×10-8mol/L;全反式,Sigma)的RPMI 1640半固态培养基(含青霉素5×104U/L, 链霉素50mg/L, 维生素C 0.2g/L,琼脂5g/L)表面,以不含外源性RA的培养基作对照,于37℃,含50ml/L CO2的恒温恒湿培养箱中继续培养4、5、6d，每48h更换新鲜配制的培养基1次。培养结束后分别用TRIzol RNA提取试剂盒(Gibco)提取总RNA;用RT-PCR试剂盒(Gibco)扩增30循环(具体操作步骤依据试剂盒要求进行),同时以肌动蛋白(actin)为内参照cDNA。采用Southern印迹法(探针为Digoxigenin标记的寡核甘酸探针)检测BSP mRNA在体外培养牙胚组织中的表达变化。

2　结果

　　实验组和对照组的牙胚培养4d后均未出现BSP mRNA表达。培养5d后，实验组的牙胚开始表达BSP mRNA，而对照组的牙胚仍然为阴性。培养6d后，实验组牙胚BSP mRNA表达明显增强, 同时对照组的牙胚也开始表达BSP mRNA，但表达强度明显低于实验组的牙胚(图1)。

图1　维甲酸对鼠磨牙牙胚BSP基因表达的诱导

3　讨论

　　牙胚发育是一个连续的生物学过程，经历了牙板形成期、蕾状期、帽状期、钟状期以及硬组织形成期等。16d胎龄的鼠胎下颌第一磨牙牙胚处于钟状期早期，牙胚组织细胞（成牙本质细胞和成釉细胞）尚未分化成熟，这个发育阶段的牙胚用来研究牙胚组织细胞的分化较理想。
　　RA是维生素A在体内代谢后的主要活性产物，具有调节细胞增殖与分化的功能，在维持胚胎发育以及人体正常功能等方面发挥重要作用［5］。在牙胚发育过程中，RA是牙胚冠部形态发生不可缺少的成分，但能否诱导牙胚组织细胞的分化目前尚无定论［6］。以往在观察牙胚发育的过程时，主要采用一般组织形态学观察的方法，依据细胞的形态决定细胞的分化程度。最近的研究发现，矿化组织（牙齿、骨和软骨）中存在一些特异性非胶原糖蛋白，由特定的组织细胞表达。根据这些蛋白的基因表达，可以推断特定细胞的分化程度。

责任编辑：姚红祥