图1　蕾状期PCD阳性细胞散在于上皮细胞形成的蕾状突起中央区及头部　NBT+BCIP　×200

图2　帽状期PCD阳性细胞集中出现在以内釉上皮中心为主的区域　NBT+BCIP　×132

图3　帽状期PCD阳性细胞出现在颈环和邻近颈环的周围间充质细胞中　NBT+BCIP　×132

2.2　TUNEL法观察
　　胚胎13天,口腔上皮细胞增生内陷呈蕾状突起，PCD阳性细胞集中在上皮细胞形成的蕾状头部，邻近间充质细胞增生活跃，偶见PCD阳性细胞（图4）。胚胎15天帽状期,细胞增生活跃，成釉器及牙乳头和牙囊已形成。PCD阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域（原发性釉结节）及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，其中已分化的内釉上皮细胞约占30％，星网层细胞约40％，牙乳头中的间充质细胞约占30%，余者偶见（图5）。胚胎17天钟状早期,PCD阳性细胞明显增多，主要集中在成釉器的未来牙尖形成部位（继发性釉结节）及颈环处，内釉上皮细胞中约40％，其邻接的星网层细胞约30％,间充质细胞约25％，其余部位散在（图6）。胚胎19天钟状期，成牙本质细胞已分化，开始分泌牙本质基质，在成牙本质细胞中PCD阳性细胞约有20％，在成釉器的星网层细胞约占30％，牙乳头中的间充质细胞约占20％，其它部位散在。生后1天牙本质、牙釉质基质均已开始形成，成釉器逐渐退化，PCD阳性细胞在星网层细胞多见约30%，间充质细胞约20%，其余偶见。生后3天牙体组织形成期，牙本质、牙釉质基质逐渐分泌增加，成釉器不断退化，PCD阳性细胞在成釉器的星网层细胞约25％，间充质细胞约15％，其余部位少见。生后5天牙本质、牙釉质基质进一步钙化形成,成釉器进一步退化，PCD阳性细胞逐渐较少。生后7天随着基质钙化形成，牙胚各部分细胞成分明显减少，PCD阳性细胞也少见。

图4　蕾状突起头部及周围间充质细胞中PCNA阳性细胞广泛分布　NBT+BCIP　×132

图5　帽状期PCNA阳性细胞集中分布于颈环周围　×200

图6　牙体组织形成期PCNA阳性细胞集中出现在成牙本质细胞层　×200

3　讨　　论

　　发生于发育过程中的细胞凋亡是一些生物性因子或激素通过细胞膜或细胞内受体介导的细胞自然死亡现象。多用于揭示在胚胎发育、个体成熟等复杂的生理及病理过程中，在特定的时间、空间所发生的一种主动接受基因调控的程序性细胞死亡。目前已知细胞凋亡在组织、器官发育形成过程中具有组织塑形，消除不必要结构，控制细胞数量，清除多余、衰老、异常的细胞的作用。因此，本研究采用细胞凋亡特异性原位末端标记法，可以特异显示细胞凋亡在牙齿发育过程中的变化规律［4,5］。
　　PCNA是一种DNA多聚酶δ的辅助因子，是细胞增殖分裂所必须的成分之一，是一种只出现在细胞增殖状态细胞核内的酸性蛋白质。它在细胞增生分裂的S期达到高峰，因此，PCNA阳性着色细胞主要反映处于S期增殖状态的细胞。本实验通过免疫组化染色观察不同时期牙齿发育过程中PCNA的情况，揭示PCNA与细胞凋亡在牙齿发育中的关系。
　　结果表明:在牙胚发育的蕾状期，蕾状突起头部的星形细胞及周围上皮细胞、间充质细胞中PCNA阳性细胞广泛分布，这时PCD活跃在生长中心蕾状突起的头部，说明从牙蕾开始形成到蕾状期发育完成，上皮细胞增殖极其活跃，此时的PCD调控着细胞增殖数量，可能是上皮性成釉器不断向下生长的需要，也可能是牙蕾形态形成所必需的一种主动塑形现象。帽状期PCNA阳性细胞主要集中在内釉上皮中心区域（原发性釉结节）及内外釉上皮细胞增殖形成颈环处，此时，PCD也出现在帽状成釉器中以内釉上皮为中心的生长中心（原发性釉结节、颈环）处，提示原发性釉结节及颈环是牙齿发育的中心。这些部位通过上皮间充质相互诱导作用，细胞不断分裂、增殖的同时PCD在调控着细胞的增殖和分化，调控着牙尖、牙颈、牙根部的形成。使牙胚得以不断发育及塑形。这可能是牙胚不断向外生长扩大及不断塑形的需要。牙齿发育进入钟状期，PCNA及PCD阳性细胞集中在成釉器未来牙尖形成部位（继发性釉结节）及颈环处，说明继发性釉结节是钟状期的牙齿生长中心。已有研究表明继发性釉结节是控制牙尖形成的信号中心，此期同样通过PCNA的表达及PCD出现发挥着调控牙齿发育及塑形。进入牙体组织形成期随着成釉细胞、成牙本质细胞的分化成熟，牙本质、牙釉质基质的分泌形成，成釉细胞、成牙本质细胞及星网层、牙乳头细胞均有PCNA的表达及PCD阳性细胞，说明成釉细胞、成牙本质细胞增殖旺盛分泌基质的同时，通过PCD清除已经结束生命周期的、衰老的、多余的上皮及间充质细胞，控制着细胞数量，消除继发性釉结节、星网层等暂时性结构。可见，在牙齿发育过程中，PCNA和PCD相互协调作用，及时调控着细胞的增殖和分化，及时清除异常、衰老的细胞，在牙齿形态形成过程中，发挥重要的塑形作用。

责任编辑：姚红祥