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2.取样和检查：从每例患者口腔内选择有牙龈炎症的6颗牙作为取样牙。以棉球隔湿，吹干后分别用消毒刮匙刮取龈上、龈下菌斑，即刻检查并记录牙周临床指数：菌斑指数(plaque index，PLI)、探诊深度(probing depth，PD)及出血指数(bleeding index，BI)。
3.提取DNA：按PCR试剂盒的要求快速提取菌斑样本中的DNA，将菌斑悬浮于100 μl样本处理液(BIO-RAD Co)中，56℃孵育30 min，高速震荡10 s后置100℃水浴8 min，再次高速震荡10 s，离心(12 000 r/min, 4 ℃)3 min。取上清用于PCR扩增。
4.PCR检测Hp: PCR试剂盒(Pacific Econ-Tech Co.U.S.A.）内含两对引物，预期扩增片段为294bp及400bp。20 μl反应体系含有两对引物各20 pmol/L，每种寡核苷酸4 mmol/L，DNA模板4μl，Taq DNA聚合酶2U及PCR缓冲液。反应在TMRobocycle gradient 40 型扩增仪（Stratagene公司）上进行。94 ℃预变性5 min，以94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min为1个循环，共计35个循环，最后1次循环72℃继续延伸7 min。以Hp标准株NCTC 11637(中国预防医学科学院陈晶晶教授惠赠)和1株Hp临床分离株（北京医科大学肿瘤学院）的DNA提取液分别作为阳性对照，采用PCR试剂盒内的阴性对照。用8％丙烯酰胺电泳鉴定PCR产物。为减少污染机会，DNA提取、PCR扩增及电泳分析分别在3个房间进行。
5.PCR敏感性和特异性试验：Hp纯培养72 小时，刮取菌落以生理盐水稀释，镜下计数测得菌液浓度。用样本处理液10倍系列稀释后使菌液每4μl含1、10、102、103、104及105个细菌，提取DNA用于PCR扩增。另外，提取牙龈卟啉菌、直弯曲菌、唾液链球菌、解脲类杆菌及大肠杆菌（均为国际标准株）的DNA，与被测样本同时进行PCR扩增。
结果
1.PCR方法的敏感性和特异性：本实验所用的PCR方法最少能检测到100个Hp细菌。扩增的上述5种其他细菌均为阴性，说明本方法敏感性和特异性较好。
2.牙周临床检查结果：胃病组的PD及BI均小于牙周炎组，胃病组分别为(2.76±0.98)mm及2.69±0.78，牙周炎组分别为 （5.74±1.42）mm及3.12±1.09，两组间比较P＜0.01，差异有极显著性。两组患者的PLI相近，胃病组为2.62±0.69, 牙周炎组为2.15±0.76，两组间比较P＞0.05，差异无显著性。
3.菌斑中的Hp检测：胃病组和牙周炎组菌斑中Hp的PCR检查结果见表1。胃病组中的11例及牙周炎组的全部患者均至少有1份菌斑样本中检出Hp，其中胃病组尿素酶C基因阳性率为28.8％（45/156），尿素酶C基因和cagA基因共同阳性率为3.2％（5/156），牙周炎组尿素酶C基因阳性率为49.2%（59/120），两种基因的共同阳性率为3.3％（4/120）。表2结果显示，龈下菌斑中Hp的检出率显著高于龈上菌斑(P＜0.01)。
4.Hp与牙周临床指标的相关关系：用Kendall-test分析Hp检出率与牙周临床指数的相关关系。在PD≥4mm的位点，菌斑中Hp检出率高于PD＜4mm的位点(P＜0.01)；而PD在4～5 mm处与大于6 mm处的龈下菌斑中，Hp检出率无明显差异(P＞0.05)。Hp的检出率与取样部位的BI明显相关(P＜0.05)。
表1 两组患者牙菌斑中幽门螺杆菌的PCR检测结果
| 组别 |
例数 |
U(+) |
U+C(+) |
菌斑标
本数 |
U(+) |
U+C(+) |
| 例数(%) |
例数(%) |
份数(%) |
份数(%) |
| 胃病 |
13 |
9(69.2) |
2(15.4) |
156 |
45(28.8) |
5(3.2) |
| 牙周炎 |
10 |
7(70.0) |
3(30.0) |
120 |
59(49.2) |
4(3.3) |
| 两组合并 |
23 |
16(69.6) |
5(21.7) |
276 |
104(37.7) |
9(3.3) |
注：PCR：聚合酶链反应；U(+)：尿素酶C基因阳性；U+C(+)：尿素酶C基因及cag a基因均阳性
表2 Hp在龈上和龈下菌斑中的分布
| 组别 |
菌斑标
本数 |
龈上菌斑中Hp阳性数 |
龈下菌斑中Hp阳性数 |
| U(+)(%) |
U+C(+)(%) |
U(+)(%) |
U+C(+)(%) |
| 胃病 |
156 |
15/78(19.2) |
3/78(3.8) |
30/78(38.5 ) |
2/78(2.6) |
| 牙周炎 |
120 |
21/60(35.0) |
2/60(3.3) |
38/60 (63.3) |
2/60(3.3) |
| 两组合并 |
276 |
36/138(26.1) |
5/138(3.6) |
68/138(49.3)* |
4/138 (2.9) |
责任编辑：韩晓炜 |