【摘要】  目的   探讨胰岛素样生长因子(IGF1)对人牙周膜细胞(PDL cells)胶原合成的调节及IGF1作用的细胞内分子机理，特别是多聚腺嘌呤二磷酸核糖(PADPR)反应在IGF1调节胶原合成中的意义。方法   用体外培养的人牙周膜细胞(8～10代)，观察不同浓度的IGF1(10～100 μg/L)作用16小时后牙周膜细胞胶原合成以及细胞内乳酸代谢、PADPR合成和PADPR合成酶活性的关系。结果  IGF1能明显刺激牙周膜细胞胶原合成，同时伴随乳酸产生的增加和PADPR合成酶活性下降、PARPR合成减少。结论   IGF1可能通过影响PADPR合成而调节牙周膜细胞胶原合成。
【关键词】 胶原    胰岛素样生长因子1     牙周膜细胞

    胰岛素样生长因子1(insulin-like grwoth factor 1, IGF1)能对多种细胞产生广泛的生物活性［1］，包括促进细胞生长、分化及创口愈合等。已知IGF1的作用是通过与靶细胞表面特异性受体相结合［2］，但从IGF1与受体结合至调节基因表达的细胞内过程，目前尚不清楚。有报道认为，IGF1能促进体外培养的成纤维细胞、软骨细胞和成骨细胞合成胶原［3］。牙周膜细胞是促进牙周组织再生的主要细胞，探讨牙周膜细胞胶原合成的调节是研究牙周组织再生的重要课题。多聚腺嘌呤二磷酸核糖［poly(ADP-ribose)，简称PADPR］化修饰是细胞核内调节蛋白质功能的一个独特生化过程，我们曾报道过PADPR对牙周膜细胞α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)胶原基因表达的调节［4］。本项研究着重探讨IGF1对牙周膜细胞胶原合成的调节及PADPR反应在这一调节过程中的作用。

材料和方法

一、牙周膜细胞培养

    将因阻生而拔除的第三磨牙经无菌生理盐水冲洗后，彻底刮净龈缘向1/3的牙周组织。刮取其牙根中1/3的牙周组织，在1%胰蛋白酶、0.125%胶原酶溶液中37℃孵育1小时；然后在含有10%灭活胎牛血清、100 mg/L链霉素、100 000 U/L青霉素、50 g/L庆大霉素的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2条件下培养。实验用细胞为第8～10代。

    二、胶原合成的测定［5］

    在直径100 mm的培养皿中，当细胞生长呈单层贴壁致密分布后，在无血清条件下培养48小时。再以4个培养皿的细胞为一组，在不同浓度的人重组IGF1(Boehringer Mannhein公司产品)条件下培养16小时。同时，为测定胶原的合成，对培养的细胞给予10 mCi/L L-3H脯氨酸(3 441 GBq/mmol, Amersham公司)、50 mg/L抗坏血酸。收集培养液和细胞，将细胞制成匀浆，培养液和细胞匀浆经透析去除游离的3H脯氨酸。然后，经高纯化胶原酶(Advanced Biofactures公司)在37℃下分解8小时，再透析，测定析出的3H，以其代表合成胶原的量。对各样本均测定其DNA含量以保证样本间的可比性。

    三、乳酸浓度的测定

    呈单层贴壁致密分布的细胞在不同浓度的IGF1或IGF1与2-脱氧D-葡萄糖(2-DG)条件下培养16小时后，取培养液，在YSI-27型乳酸分析仪上直接测定培养液中的乳酸盐浓度。

    四、PADPR合成酶活性的分析［6］

    呈单层贴壁致密分布的细胞在不同浓度的IGF1条件下培养16小时后，收集细胞，制成匀浆，9 000r/min离心30分钟。上清液中PADPR合成酶的活性，以其催化14C -NAD+合成不溶于酸的PADPR的量值来表示。反应液总体积为0.15 ml，组成为：50 mmol/L Tris缓冲液(pH7.5)，15 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2,10 mmol/L NaF, 0.1 mmol/L DTT, 3 mmol/L cAMP, 10 μg DNA, 20 μg牛血清白蛋白，96 μmol/L 14C-NAD+(67μCi/μmol)。于37℃下反应15分钟后，加2 ml 10%三氯醋酸(TCA)，经密滤膜(孔径0.45 μm)过滤，5%TCA冲洗后，测定密滤膜上14C的量。各样本均测定DNA的含量，以保证样本间的可比性。

责任编辑：姚红祥