|
五、PADPR合成量的测定［7］
当细胞呈单层贴壁致密分布后，给予不同浓度的IGF1和37 kBq/L14C-NAD+(10μCi/μmol)条件下培养16小时，然后收集细胞，经NP-40溶解液(10 mmol/LTris缓冲液, pH 7.4, 10 mmol/L NaCl, 3 mmol/L MgCl2, 0.5% Nonidet P-40)处理5分钟，500r/min离心5分钟。收集细胞核，经20 mg/L脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶于37℃分解20分钟，收集于密滤膜，测定膜上不溶于酸的14C放射剂量，以其表示合成的PADPR量。对各样本均测定其DNA含量，以保证样本间的可比性。
六、统计学分析
组间差异采用误差单向分析和非配对资料t检验。
结 果
一、IGF1对牙周膜细胞胶原合成的作用
牙周膜细胞经IGF1作用16小时后，其总蛋白质及胶原的合成都明显增加，而以胶原合成的增加更为明显。与对照组相比，10 mg/L IGF1即可明显促进牙周膜细胞胶原的合成，IGF1的作用还随其浓度增加而增强(表1)。
表1 IGF1对牙周膜细胞胶原合成的作用
| 处理方法 |
总3H脯氨酸掺入量
(104dpm/μg DNA) |
对胶原酶敏感的
放射活性
(103dpm/μg DNA) |
| 对照组 |
2.46±0.28 |
1.86±0.23 |
| IGF1，10(μg/L) |
3.83±0.41* |
2.97±0.36* |
| 25(μg/L) |
5.76±0.62* |
4.52±0.47* |
| 50(μg/L) |
6.12±0.65* |
6.31±0.69* |
| 100(μg/L) |
7.51±0.80* |
9.16±0.98** |
*P〈0.05,差异有显著性；**P〈0.01，差异有非常显著性
二、IGF1对牙周膜细胞乳酸产生的作用
IGF1在25 μg/L浓度时即能增加牙周膜细胞乳酸的产生，随着其浓度增加作用更加明显。而6 mmol/L 2-DG能完全阻断IGF1的这一作用。即使在50 μg/L和100 μg/L IGF1作用下，6 mmol/L 2-DG的存在亦可使牙周膜细胞产生乳酸的浓度与无IGF1作用者无差别，见附图。
附图 IGF1(胰岛素样生长因子1)对牙周膜细胞产生乳酸的作用
三、IGF1对牙周膜细胞PADPR合成酶活性和PADPR合成的作用
牙周膜细胞经IGF1作用后，其细胞核内PADPR合成酶活性明显下降。同时，在IGF1作用下，牙周膜细胞合成PADPR的量也明显下降，见表2。
表2 IGF1对PADPR合成酶活性及FADPR合成的作用
IGF1浓度
(μg/L) |
PADPR合成酶活性
(103dpm/mg DNA) |
PADPR合成量
(103dpm/mg DNA) |
|
0 |
16.74±3.23 |
2.33±0.42 |
| 10 |
13.31±2.41* |
1.98±0.37(NS) |
| 25 |
8.27±1.03** |
1.79±0.26* |
| 50 |
6.07±0.84** |
1.54±0.22* |
| 100 |
4.86±0.69** |
1.17±0.19* |
*P〈0.05，**P〈0.01，NS：差异无显著性
四、外源性NAD+对IGF1促进胶原合成的作用
使牙周膜细胞在2 mmol/L NAD+条件下培养4小时，然后给予不同浓度的IGF1
作用，观察胶原的合成情况。结果发现，经2 mmol/L NAD+处理，明显降低了IGF1
对牙周膜细胞胶原合成的刺激作用(表3)。
表3 外源性NAD+对IGF1促进胶原合成的影响
| IGF1(μg/L) |
对胶原酶敏感的放射活性(103dpm/μg DNA) |
| 无NAD+对照 |
加NAD+(2mmol/L) |
|
25 |
4.52±0.47 |
1.61±0.22** |
| 50 |
6.31±0.69 |
2.31±0.30** |
| 100 |
9.16±0.98 |
4.18±0.53 | **P〈0.01，差异有非常显著性
讨 论
我们上述研究结果表明，IGF1能明显刺激体外培养的牙周膜细胞合成胶原。为了探讨IGF1作用的细胞内分子机理，我们观察了IGF1对牙周膜细胞PADPR合成的作用，发现IGF1能降低牙周膜细胞内PADPR合成。在以往的研究中，已揭示PADPR反应可抑制牙周膜细胞α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)胶原基因的表达［4］，说明IGF1可能通过减少PADPR合成而促进牙周膜细胞胶原的生成。
责任编辑：姚红祥 |