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提 要 目的 检测咬合力在正常及丧失状态下，大鼠牙周细胞TNF—α的动态表达，初探TNF—α在牙周组织改建中的分子机理。方法 采用HE染色和免疫组化的方法，观察牙周形态变化以及牙周组织中TNF—α蛋白表达。结果 咬合力丧失引起牙周膜结构紊乱、牙槽骨吸收。同时，牙周细胞中TNF—α表达较正常咬合力时明显增强。结论 咬合力丧失，促使TNF—α明显增多。本实验从分子水平探讨了牙周组织改建的机理；揭示了牙周组织结构与功能在改建中的一致性。
关键词 咬合力 肿瘤坏死因子—α 牙周组织改建 免疫组化
肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF)是一种重要的细胞因子，有着广泛的生物学活性。TNF—α是重要的破骨细胞活化因子之一，它和其他细胞因子（如IL—1β、IL—6）一起，共同参与着骨的改建。
本实验研究了大鼠咬合力丧失对牙周组织的形态学影响以及TNF—α在牙周组织中表达的动态变化。初探了TNF—α在不同咬合力作用下对牙周组织改建影响的分子机理。
材料和方法
动物模型
选用80只250g±20成年雄性Wistar大鼠，随机等量地分为对照组（正常咬合力）和实验组。实验组拔除左侧上颌（B区）所有磨牙。这样，实验组的D区磨牙因丧失对颌牙而构成咬合力丧失的动物模型。两组动物分别在实验后6小时、1天、2天、3天、1周、2周、3周和4周各处死5只，共16组。
组织标本制备
实验动物采用4％多聚甲醛心内灌注的方式行内固定。取出下颌相应骨段，保留磨牙区，置于4％多聚甲醛中巩固固定6小时。将标本移至EDTA中脱钙2周。梯度乙醇脱水，石蜡包埋。标本厚5μm，裱于经硅化处理的玻片上。
实验方法
1. 组织形态学 取相应切片进行苏木素一伊红（HE）染色，在光学显微镜下观察牙周形态变化，并用显微标尺对牙周膜宽度进行测量。
2. 免疫组化 TNF—α单克隆抗体（四军大病理教研室提供），ABC试剂盒（美国Vector公司）。常规免疫组化染色，DAB显色。设已知有TNF—α表达的应激大鼠脾组织作阳性对照，以封闭血清代替一抗作阴性对照。
图像分析与统计学处理
采用MIAS—2000型图像分析仪，对实验组和对照组各时间点牙周膜染色强度进行测量。每个标本均选第一磨牙牙根为观察对象。结果用t检验进行统计学分析。
结 果
组织形态学
1. 对照组（正常咬合力）大鼠牙周膜结构致密，纤维排列有序，成纤维细胞胞核的方向与之一致。牙槽骨骨壁较平，表面衬以连续排列的扁平成骨细胞。
2. 实验组（咬合力丧失）2周时牙周膜结构稀疏，纤维、细胞的排列明显紊乱；牙槽骨骨壁凹凸不平，有很多骨吸收陷窝，其内可见破骨细胞。3周、4周时，牙周膜结构更加紊乱；牙槽骨仍凹凸不平，但牙槽骨中的破骨细胞数量减少。
免疫组化
1. 对照组大鼠牙周膜成纤维细胞（PLF）能稳定表达TNF。其免疫阳性信号位于胞浆内。牙槽骨成骨细胞未见TNF—α明显表达。
2. 实验组牙周膜表达TNF—α的阳性强度明显高于对照组（表1），且表达有一定的时间规律：3天后出现明显变化，随后阳性强度逐渐增大，2周达最大值，然后逐渐减小，4周时基本恢复正常。实验组2周时观察到成骨细胞中TNF—α明显表达。
表1 对照组和实验组不同实验时间牙周膜TNF—α免疫组化染色灰度差值表
| 实验时间 |
对照组（正常） |
实验组（丧失） |
| 6小时 |
14.3739 |
14.6148 |
| 1天 |
14.2973 |
15.0287 |
| 2天 |
14.1117 |
16.4635 |
| 3天 |
15.3812 |
24.2217 |
| 1周 |
14.8654 |
30.0560 |
| 2周 |
14.6541 |
41.9832 |
| 3周 |
15.0085 |
30.7648 |
| 4周 |
14.8923 |
16.4741 |
（说明：其中*为两组比较的概率值。“*”表示P<0.01，有显著性差异。无星号者，P>0.05，无显著性差异。）
讨 论
本实验HE染色观察到，咬合力丧失引起牙周膜结构紊乱，牙槽骨吸收。免疫组化结果显示，正常咬合力状态下大鼠牙周膜成纤维细胞（PLF）能稳定表达TNF—α。咬合力丧失后，牙周膜表达TNF—α的强度明显增强，且牙槽骨（靠近骨面处）成骨细胞中2周时表达也明显增强。本实验提示，咬合力丧失，诱导PLF和成骨细胞产生了明显增多的破骨因子TNF—α。
责任编辑：姚红祥 |