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〔摘要〕 目的：研究牙龈卟啉单胞菌在牙周炎患者病变部位和健康部位龈下 菌班中的分布情况。方法：选择64例成年牙周炎患者，取龈 下菌斑，经厌氧培养，挑取产黑色素菌落，经多聚酶链反应鉴定牙龈卟啉单胞菌。结果：产黑色素G厌氧杆菌和牙龈卟啉单胞菌的患者检出率分别是67.2% 和60.9%。牙龈卟啉单胞菌在病变部位和健康部位的检出率分别是35.9%和28.1%，二者差异 无统计学意义；牙龈卟啉单胞菌在病变部位和健康部位的检出株数分别是122株和85株，占 产黑色素G厌氧杆菌检出株数的32.3%和35.9%，差异无统计学意义。结论： 牙龈卟啉单胞菌可能作为内源性致病菌在特定条件下过度生长而导致牙周破坏 。
关键词 牙周炎；牙龈卟啉单胞菌；16 SrRNA；聚合酶链反应
牙周炎是细菌导致的感染性疾病。牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,Pg )是成年牙周炎(AP)的主要致病菌之一。但Pg是内源性致病菌还是外源性致病菌尚有争 议。外源性致病菌在人群中检出率低，克隆型少，健康人群或部位病原菌水平低或无，预防 和治疗措施为清除该菌。而内源性致病菌则在人群中检出率高，存在多种克隆型，因过度生 长而致病，预防措施是抑制过度生长。如能明确Pg是哪一类致病菌，即可采取相应的治 疗措施〔1〕。本文根据已报道的针对Pg 16S rRNA设计的引物〔2〕，采 用多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测AP病变部位及健康部位的Pg检 出率和数量，对其外源性或内源性致病菌的地位作初步探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 本研究采用的标准株包括Pg ATCC33277、W83，中间型普里沃菌(Pi) ATCC 25611，变黑普里沃菌(Pn)ATCC37665，产黑色素普里沃菌(Pm)ATCC25845，不 解糖卟啉单胞菌(Pa)ATCC25260，躯体普里沃菌(Pc)ATCC33547，小齿普里沃菌(P d)ATCC33185由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供。临床分离614株产黑色素G 厌氧杆菌菌株。
1.1.2 引物合成 根据Garcia等报道的16S rRNA引物序列，由美国GIBCO BRL公司合成引物 1(P1)和引物2(P2)，P1-5'CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG3'和P2-5'TACATAGAAG CCCCGAAGGAAGACG3'扩增片段为527 bp。
1.1.3 试剂 本研究采用的主要酶和试剂包括Taq DNA聚合酶、10×Buffer缓冲液、dNTP、 PBR322/Hae Ⅲ等由美国GIBCO BRL公司提供。
1.2 方法
1.2.1 病例选择 64例AP患者，年龄21～72岁，全身无系统性疾病，3月内无抗生素治疗史 。每位患者至少有两个牙周袋深≥4 mm，探诊明显出血。每位患者选择两个牙周正常(牙龈 沟深≤2 mm，探诊无出血，牙龈无明显炎症)的牙位作为健康部位。
1.2.2 标本的采集及厌氧培养 每个取样部位插入两根无菌纸尖至袋底或龈沟底，停留15 s，放入装有1 ml预还原转送液的离心管。振荡，稀释，接种于牛心脑浸液平皿，37 ℃，在厌氧环境(含CO2、H2、N2的体积分数分别为10%、10%、80%)培养5～7 d。挑 取黑色菌落，镜检为G杆菌者，取单个菌落，放入装有无菌蒸馏水的离心管内。
1.2.3 PCR反应 以Pg ATCC33277的DNA为模板作阳性对照，以加除Pg ATCC33277 DNA外的PCR系统所有其他成份及加Pg ATCC33277 DNA模板不加引物为阴性对照，分别以 8种标准株细菌DNA和614株临床标本DNA为模板进行PCR检测。将混悬有单个菌落的离心管煮沸5 min，离心1164 g×5 min，取上清液作为模板DNA备用。PCR扩增总反应体 系50 μl，其中三蒸水30 μl,10×Buffer缓冲液5 μl，2.5 mmol/L Mg2+5 μl，d NTP(含4种脱氧核苷酸1.25 mmol/L)4 μl,Taq DNA聚合酶2.5 U,引物(P1P2)50 μmol/L各0 .5 μl,模板DNA5 μl。在0.5 ml的离心管中，依次加入以上试剂，混匀，加入20 μl石蜡 油，进行PCR反应。PCR反应程序：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火70 ℃ 45 s ，延伸72 ℃ 30 s，38次循环，延伸72 ℃ 10 min。
责任编辑：姚红祥 |