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4．细胞结合型GTF的提取［4］： 800 ml TTY培养基中24 h培养的MT8148，4℃离心，沉淀细胞用10 mmol/L磷酸钠缓冲液4℃反复洗3次，加入8 mol/L脲素22.5 ml，置25℃水浴中1 h，偶尔震摇。4℃下10 mmol/L磷酸钠缓冲液透析至无NH3检出为止。离心，上清即为细胞结合型GTF的粗提物（以下简称酶粗提物）。
5．酶活性的测定： 酶的反应混合液由50 μl 酶粗提物、100 μl含3%蔗糖溶液的0.1 mol/L磷酸钠缓冲液、不同剂量的乳清（免疫或对照或免疫吸收乳清），加入0.1 mol/L磷酸钠缓冲液，使反应混合液的总体积达300 μl。实验分为免疫乳清、对照乳清、免疫吸收乳清及空白对照共4组。前3组根据加入乳清剂量的不同，再分为3个小组，剂量分别为50、70及90 μl。空白对照组在反应混合液中不加任何乳清。以上各组一式三份，结果取均值。反应程序为：加入酶粗提物、乳清及缓冲液，37℃孵育30 min，然后加入蔗糖溶液，蔗糖终浓度为1%。37℃反应2 h。冰上终止反应，离心收集反应合成的ISG，蒸馏水反复洗3次。ISG的量采用蒽酮法测定，以葡萄糖为标准。统计学分析采用方差分析。
结果
一、 3种不同的乳清影响GTF合成ISG活性的比较（表1）
对照乳清组和免疫吸收乳清组GTF合成ISG的量与乳清的剂量之间无明显关联。免疫乳清在不同剂量条件下，抑制酶活性作用的强度差异无显著性，但有剂量依赖性趋势，即随着免疫乳清量的增加，抑制作用增强。与对照乳清相比，免疫乳清和免疫吸收乳清均可抑制GTF活性，免疫吸收乳清在90 μl时有明显的抑制作用（P＜0.01）。而免疫乳清在50 μl时即表现出抑制作用（P＜0.05），并随着剂量的增加作用增强（90 μl时P＜0.01）。
表1 3种乳清对葡萄糖基转移酶合成水不溶性葡聚糖量的影响（μg，±s，n=3）
| 乳清剂量（ μl） |
对照乳清 |
免疫吸收乳清 |
免疫乳清 |
| 50 |
65.65±26.91 |
34.67±7.77 |
11.33±6.91* |
| 70 |
78.33±41.04 |
44.03±2.11 |
12.00±7.85* |
| 90 |
72.17±13.70 |
33.67±1.01** |
6.23±2.16** |
注：空白对照组水不溶性葡聚糖的合成量为（16.13±5.42）μg；与对照乳清相比*P＜0.05，**P＜ 0.01
二、 乳清对酶活性的增强作用
空白对照组GTF合成ISG的量为16.13μg。对照乳清组在3种剂量条件下ISG的合成量为65.65～78.33 μg，ISG的合成量为空白对照组的407.00%～485.62%，这表明对照乳清可以明显地增强细胞结合型GTF合成ISG的能力 （P＜0.05）。免疫吸收乳清也有这种增强作用，3种剂量条件下ISG的合成量为空白对照组的208.74%～273.00%（P＜0.05）。而免疫乳清则在3种剂量条件下均可抑制GTF合成ISG，加入量为50 μl时，ISG的合成量仅为空白对照组的70.24%，当剂量达90 μl时，下降至 38.62%，这表明免疫乳清可完全抵消乳清中的其他成分对酶活性的增强作用，并在此基础上发挥抑制作用。免疫吸收乳清仅可部分抑制这种增强作用。
讨论
本研究比较了3种乳清对细胞结合型GTF合成ISG活性的影响。结果显示，对照乳清可以增强GTF的活性达3倍以上，这与Loimaranta等［5］的研究结果相似，在他们的研究中，对照乳清组细胞结合型和细胞游离型GTF合成ISG的活性分别为无乳清组的120%和160%。两种结果的差异可能与酶反应混合物的组成、反应条件等因素不同有关。
为了观察GTF过表达株单株全菌疫苗是否可诱导产生足量的抗变链菌GTF的特异性抗体，研究中采用B-29吸收免疫乳清中的其他特异性抗体。大多数变形链球菌至少含3种gtf基因，即gtfB、gtfC和gtfD。gtfB编码GTFI催化合成ISG，gtfD编码GTFS合成水溶性葡聚糖（soluble glucan，SG），gtfC编码的GTFIS既合成SG也合成ISG。研究表明GTFI与GTFIS 和GTFI之间存在序列同源［7，8］。B-29-33和B-29的构建是以MT8148为亲代株，采用基因工程手段获得［1，6］，B-29-33为细胞结合型GTF过表达株，B-29为gtfB缺陷株。用B-29吸收乳清中的抗体后，免疫吸收乳清对GTF的抑制作用减弱，不足以抵抗乳清中某种物质对酶活性的增强作用。推测是由于GTFI与GTFIS 和GTFI之间存在序列同源，吸收了一部分抗GTF抗体。但随着剂量的增加，ISG的合成量也明显少于对照乳清中ISG的合成量（90 μl时，P＜0.01），推测是由于免疫吸收乳清剂量的增加，其中残留的抗GTF抗体的量随之增加，抑制作用的强度也增强的结果。本研究结果与Loimaranta等［5］的结果基本一致。在他们的研究中观察到，细胞结合型和细胞游离型GTF的活性均可被免疫乳清抑制，抑制作用也呈剂量依赖性，要求免疫乳清冻干粉的浓度超过1%以上时，才出现抑制作用。我们的研究结果显示，当免疫乳清和免疫吸收乳清达90 μl时，可以获得较好的抑制效果。
责任编辑：姚红祥 | 
